支气管哮喘豚鼠肺组织中KLF2的表达及意义

目的：探讨锌指Krüppel样转录因2（KLF2）在豚鼠支气管哮喘肺组织中的表达及意义。方法：30只健康雄性豚鼠,按随机数字表法分为对照组（A组）、哮喘组（B组）及地塞米松治疗组（C组）,每组10只。卵清蛋白致敏法复制哮喘模型。观察豚鼠肺组织病理学改变,BALF细胞总数及分类计数;采用原位杂交和RT-PCR检测肺组织中KLF2的mRNA表达情况,免疫组化和Westernblot检测肺组织中KLF2的蛋白表达水平。结果：（1）哮喘组豚鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比（EOS%）、中性粒细胞百分比（NEU%）显著高于对照组（P〈0.01）,哮喘组肺组织可见大量炎症细胞浸润,及明显气道重塑改变,而地塞米松治疗组BALF炎细胞浸润及肺组织病理改变较哮喘组明显减轻;（2）KLF2mRNA和蛋白在哮喘组表达显著低于对照组,在地塞米松治疗组中的表达明显高于哮喘组,3组差异均有统计学意义（P均〈0.01）;（3）KLF2蛋白以及mRNA与肺泡灌洗液炎细胞总数及EOS%,NEU%呈负相关。结论：KLF2在支气管哮喘急性发作期模型中表达明显下降,而地塞米松治疗后KLF2的表达上调,提示KLF2可能在支气管哮喘的发病机制与防治中起重要作用。     

PPARγ/PGC-1α在支气管哮喘豚鼠肺组织中表达及作用

目的:观察PPARγ和PGC-1α在豚鼠支气管哮喘肺组织中表达而探索PPARγ/PGC-1α对哮喘作用机制.方法:加只健康雄性豚鼠随机化原则分成对照组(A组)、哮喘组(B组)、地塞米松(C组)和罗格列酮治疗组(D组)每组10只豚鼠.卵蛋白致敏法复制哮喘模型,第16天始每日诱喘前30min C组和D组分别给予约3至5ml溶有药物的生理盐水灌胃:C组地塞米松2mg/kg,D组罗格列酮4mg/kg连续14天.测细支气管炎症细胞浸润及支气管重塑指标,肺组织病理;原位杂交和RT-PCR检测PPARγ和PGC-1α的mRNA表达免疫组化和Western blot检测肺组织两者蛋白表达.结果:(1)哮喘组出现了明显气道重塑和炎症细胞浸润,地塞米松和罗格列酮对其起抑制作用.(2)原位杂交和RT-PCR显示PPARγ和PGC-1αmRNA哮喘组表达最低四组差异均有统计学差异(P均<0.01);免疫组化和Western blot显示PPARγ和PGC-1α蛋白哮喘组表达几乎都呈阴性而且以核内表达为主,四组差异均有统计学意义(P均<0.01);地塞米松和罗格列酮可上调PPARα和PGC-1γ蛋白以及mRNA的表达.(3)支气管哮喘豚鼠肺组织PPARγ与PGC-1α表达呈正相关,PPARγ和PGC-1α蛋白以及mRNA与浸润的嗜酸粒细胞、Wal%、SMC-A%呈负相关.结论:PPARγ/PGC-1α在卵蛋白致敏急性支气管哮喘模型中表达下降,罗格列酮和地塞米松一样可上调PPARγ/PGC-1α,PPARγ/PGC-1α对哮喘发病起重要作用而可能为哮喘防治开辟新途径.     

香烟烟雾暴露对支气管哮喘大鼠肺组织水通道蛋白5表达的影响

目的探讨香烟烟雾暴露对支气管哮喘大鼠肺组织水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)和黏蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分为3组(n=10),对照组雾化生理盐水,哮喘组采用卵清白蛋白(OVA)致敏并吸入激发制备哮喘模型,哮喘+烟雾暴露组于每日雾化激发OVA前给予香烟烟雾吸入。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞计数及分类,测定肺组织病理变化及湿干重比值。实时定量PCR(Realtime PCR)测定AQP5和MUC5AC mRNA的表达,免疫组化法测定AQP5蛋白分布情况,免疫印迹法(Western blot)测定AQP5蛋白的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BALF中MUC5AC的含量。结果①与对照组相比,哮喘组大鼠BALF中白细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞数量明显增加;与哮喘组相比,暴露组大鼠BALF中白细胞、中性粒细胞数量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。②与对照组相比,哮喘组和暴露组大鼠肺组织中AQP5表达明显减少,而MUC5AC蛋白含量明显增加;与哮喘组相比,暴露组大鼠肺组织中AQP5明显减少,而MUC5AC蛋白含量明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。③肺组织中AQP5表达与肺组织BALF中MUC5AC蛋白含量呈负相关(r=-0.852和-0.895,P<0.05)。结论香烟烟雾暴露可导致哮喘大鼠肺组织AQP5表达减少而MUC5AC含量增加,进一步加重哮喘气道炎症和黏液高分泌反应,这可能为哮喘吸烟患者的早期防治提供新思路。     

地塞米松对哮喘豚鼠血清白细胞介素-4 变化及肺组织形态的影响

目的:观察地塞米松对哮喘豚鼠血清白细胞介素-4(IL-4)及肺组织形态的影响,探讨糖皮质激素治疗哮喘的机制。方法:30只健康雄性Hartley系豚鼠随机分为空白对照组,病理模型组,地塞米松组。用卵白蛋白(OVA)复制哮喘豚鼠模型。采用流式细胞术分析CD4+interleukin-4(IL-4)细胞占CD4+T细胞的比例,光镜检查肺组织形态变化。结果:病理模型组外周血中IL-4明显高于空白对照组(P<0.05),地塞米松组外周血中IL-4较病理模型组明显降低(P<0.05),且地塞米松组支气管上皮损伤,粘液腺增生等病理改变较病理模型组明显改善。结论:地塞米松治疗哮喘的作用与抑制Th2的活化,改善支气管上皮损伤,粘液腺增生等病理改变有关。     

IL-13对小鼠AGR2表达的影响及其在哮喘气道黏液过度分泌中的作用

目的研究白细胞介素-13(IL-13)对AGR2mRNA和蛋白在哮喘小鼠肺组织中表达的影响,探讨AGR2在哮喘气道黏液过度分泌中的作用。方法 18只雌性小鼠随机分为哮喘组、对照组和IL-13组,IL-13组于26d-28d激发前经鼻滴入100μg重组小鼠IL-13。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)计嗜酸性细胞分类计数。Real time-PCR方法检测肺组织AGR2mRNA表达。免疫组化法分别检测AGR2蛋白和Muc5ac蛋白在小鼠肺组织的表达。结果哮喘组BALF中嗜酸性细胞分类计数(19.1±6.34)%较正常组(0.28±0.29)%明显增多(P<0.01);IL-13组BALF中嗜酸性细胞分类计数(30.05±9.32)%较哮喘组明显升高(P<0.01)。IL-13组小鼠肺组织中AGR2mRNA(1.702±0.046)和蛋白(0.617±0.028)的表达较哮喘组(1.52±0.071,P<0.01;0.505±0.078,P<0.05)升高,IL-13组AGR2mRNA与Muc5ac蛋白的表达水平呈直线正相关(r=0.862,P<0.05);AGR2蛋白与Muc5ac蛋白水平呈直线正相关(r=0.847,P<0.05)。结论 AGR2可能参与了哮喘气道黏液过度分泌发病机制,IL-13可通过上调其表达,进一步促进黏蛋白Muc5ac表达。     

支气管哮喘豚鼠肺泡灌洗液中炎症细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达

目的探讨支气管哮喘豚鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达。方法38只健康雄性豚鼠随机分为对照组(A组)、哮喘组(B组)和地塞米松治疗组(C组),卵蛋白致敏法复制哮喘模型,收集BALF,行细胞计数和分类。离心,上清液行谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)浓度测定,细胞涂片行免疫细胞化学和原位杂交,检测γ-GCS蛋白和mRNA。结果B组嗜酸性粒细胞数(EOS)比例高于A组和C组,差异有统计学意义(P=0.000);γ-GCS免疫细胞化学B组A值最低,三组差异有统计学意义(P=0.047);γ-GCS原位杂交B组A值最低,三组差异有统计学意义(P=0.022);B组BALF中EOS比例与γ-GCS mRNA表达(A值)(r=-0.727,P=0.017)呈负相关;BALF中GSH和MDA浓度在三组间差别无统计学意义。结论哮喘组豚鼠抗氧化能力下降,抗氧化能力下降可能与炎症反应有关,糖皮质激素治疗有效。     

尘螨变应原Der f1植物表达产物诱导哮喘小鼠免疫耐受的研究

目的:采用尘螨变应原组分Der f1植物表达产物免疫治疗哮喘小鼠,了解其诱导哮喘小鼠免疫耐受的效果及机制.方法:将BALB/c小鼠分为正常组、哮喘组和治疗组,治疗组在致敏后分别给予尘螨变应原Der f1原核表达产物(rDE)和烟草叶片中的表达产物(rDP)免疫治疗,处死小鼠,取支气管肺泡灌洗液(BALF)、血清和肺组织,分别进行细胞学、螨特异性抗体、细胞因子和组织病理学检查,观察这些指标的变化.结果:哮喘组和治疗组BALF中细胞总数明显增多,中性和嗜酸性粒细胞超过50%;rDE和rDP治疗后,小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞减少;哮喘组和治疗组小鼠螨特异性IgE、IgG和IL-4水平升高,IFN-γ水平下降(P<0.01);rDE和rDP治疗后,IgE、IgG和IL-4水平下降,IFN-γ水平上升(P<0.01-0.05),以rDP疗效更好;哮喘组小鼠支气管、细支气管和小血管周围可见明显炎性细胞浸润,rDE和rDP治疗后,炎症减轻,以rDP改变更为明显.结论:尘螨变应原Der f1植物表述产物较原核表达产物能更有效地减轻螨性哮喘小鼠的气道炎症,诱导免疫耐受形成.     

牛膝多糖对哮喘大鼠信号转导子和转录激活子6表达的影响

目的：研究牛膝多糖（ABPS）对支气管哮喘大鼠支气管信号转导子和转录激活子6（STAT6）及其mRNA表达的影响。方法：雄性SD大鼠30只随机分为正常对照组、哮喘组和哮喘＋牛膝多糖组（ABPS组）。留取支气管肺泡灌洗液（BALF）进行细胞总数、嗜酸性粒细胞（E0s）和分类计数;并测定BALF和血清中白细胞介素4（IL-4）浓度;采用免疫组化法和原位杂交法分别检测STAT6蛋白和STAT6 mRNA的表达。结果：①哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均高于对照组（P〈0．01）,ABPS组上述指标均低于哮喘组（P〈0．01）;②BALF和血清中IL-4浓度哮喘组均高于对照组（均为P〈0.01）,ABPs组均低于哮喘组（均为P〈0．01）;③免疫组化和原位杂交显示,哮喘组支气管STAT6蛋白和STAT6 mRNA表达的平均吸光度（LD）均高于对照组,ABPS组则均低于哮喘组（均为P〈0．01）,其主要表达细胞是上皮细胞。结论：哮喘大鼠支气管STAT6及其mRNA较强表达,上皮细胞是其主要表达细胞;牛膝多糖有抑制哮喘气道EOS性炎症的作用．下调STAT6及其mRNA表达,使IL-4合成减少可能为其重要作用机制。     

染料木黄酮对哮喘豚鼠肺部炎症和气道重塑的预防作用

目的：研究蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂染料木黄酮对哮喘豚鼠肺部炎症和气道重塑的作用。方法：成年雄性豚鼠30只,随机分成3组（n=10）：对照组（C组）、哮喘组（A组）和染料木黄酮干预组（B组）,以腹腔内注射联合雾化吸入卵蛋白复制哮喘模型。测支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及其分类数,测细支气管炎症细胞浸润及支气管重塑指标,免疫纽化方法测磷酸化酪氨（p-tyrosine）在肺组织中的表达。结果：A组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞分类与C组比较明显增加,B组与A组比较明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）;A组细支气管嗜酸性粒细胞（E）数和淋巴细胞（L）数较C组明显增多,B组与A组比较明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）;B组细支气管重塑较A组明显减轻（P〈0．01）,与C组比较,差异无统计学意义（P〈0．05）;免疫组化显示p-tyrosine在支气管平滑肌、支气管上皮、血管滑平滑肌及炎性细胞均有表达,尤其以支气管和血管平滑肌及炎性细胞明显,A组比C组表达明显增高,差异有统计学意义（P〈0．01）,而B组与C组比较,无明显差别（P〉0．05）。结论：PTK对哮喘豚鼠肺部炎症和支气管重塑具有促进作用：PTK抑制剂染料木黄酮对哮喘豚鼠肺炎症和支气管重塑具有预防和抑制作用。     

哮喘豚鼠肺组织中的CARM1和NF-K B表达及地塞米松的干预作用

目的:探讨豚鼠支气管哮喘模型中共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)和核因子- B(NF- B)在气道和肺组织的表达变化及地塞米松的干预作用.方法:36只白色雄性豚鼠随机分为正常对照组、哮喘组和地塞米松治疗组.卵清蛋白致敏并激发后采用间接免疫荧光法检测气道和肺组织中CARM1和NF-B (P65)的表达,探讨其在哮喘中可能的作用机制.结果:CARM1和NF-κ B(P65)在对照组、哮喘组及地塞米松治疗组均有阳性表达,主要在支气管-终末细支气管上皮细胞和肺组织细胞胞核表达.CARM1和NF-κ B(P65)在哮喘组表达水平为[(123.75±41.55)和(126.92±46.74)],在地塞米松治疗组表达水平为[(84.33±27.70)和(85.00±29.22)],均高于对照组的[(51.67±8.29)和(52.75:1:9.07)个/400倍视野],地塞米松治疗组表达较哮喘组低.结论:CARM1和NF-B(P65)在哮喘豚鼠气道上皮及肺组织细胞胞核高表达,提示CARM1可能通过增强募集NF-B到相关位点激活NF-B信号转导通路并启动了多种前炎性基因和免疫调节基因的转录激活、诱发哮喘炎症反应.地塞米松可下调CARM1和NF-κ B的表达而抑制哮喘炎症反应.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.