斜纹夜蛾信息素结合蛋白SlitPBP4的分子克隆、组织表达谱及结合特性分析

【目的】鉴定斜纹夜蛾Spodoptera litura新的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,明确其在斜纹夜蛾不同组织中的表达水平并探讨其功能。【方法】基于已报道的烟草天蛾Manduca sexta、家蚕Bombyx mori、君主斑蝶Danaus plexippus和庆网蛱蝶Melitaea cinxia 4种非夜蛾科昆虫PBP4同源基因的序列特点及与其他PBP基因在染色体上的相邻关系,通过分析实验室先前克隆到的斜纹夜蛾PBP/GOBP基因序列,克隆斜纹夜蛾PBP4同源基因;通过RT-PCR和q PCR技术测定该基因在斜纹夜蛾雌雄成虫不同组织中的表达水平;利用体外表达和荧光竞争性结合实验测定斜纹夜蛾PBP4蛋白对性信息素组分和植物气味物质的结合能力。【结果】在夜蛾科昆虫斜纹夜蛾中鉴定到首个PBP4基因,命名为Slit PBP4(Gen Bank登录号:MG356847),c DNA编码210个氨基酸,具有N末端信号肽、疏水性气味分子结合域及6个保守半胱氨酸等PBP的典型序列特征,其基因组DNA在保守位置也含有2个内含子;但和已报道的斜纹夜蛾3个PBP相比,PBP4的C末端明显较长。Slit PBP4在雄成虫腹部(生殖系统)极高表达,在雌雄成虫触角及其他组织中仅微弱表达或不表达。荧光竞争性结合实验结果表明,Slit PBP4蛋白与被测定的信息素组分及植物气味物质均没有明显结合能力。【结论】报道了夜蛾科昆虫的首个PBP4基因,该基因可能主要参与雄虫生殖相关的生理过程而非嗅觉功能。     

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达

为探明谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在昆虫嗅觉识别中的作用, 本研究采用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）雄虫触角中克隆获得了1个GSTs基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EU289223）。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性比对和系统发育分析, 发现该蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员, 因此将该基因命名为HaGSTe1。同时从烟夜蛾基因组DNA中克隆获得了该基因序列, 发现序列中含有5个内含子, 长度分别为415,513,296,333和269 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对HaGSTe1在雌、 雄虫不同组织的表达进行了定性和定量分析, 结果显示, 该基因在雌、 雄虫的头部（去掉触角和喙）、触角、喙、胸、足、翅以及雌虫的腹部均有表达, 并且在雄虫触角中的表达量最高, 且显著高于雌虫触角, 这种表达情况提示其可能与触角中性信息素及其他外源物质的分解有关。     

草地贪夜蛾4个性信息素结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

草地贪夜蛾是世界性的重大害虫,2019年1月入侵我国并迅速扩散到20多个省市。性诱剂是对草地贪夜蛾进行监测和诱杀的有效手段,但是其作用识别机制仍不清楚,限制了高效性诱剂的研发和应用。性信息素结合蛋白(PBPs)在鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾性信息素识别过程中起重要作用。本研究从草地贪夜蛾中克隆了4个编码PBPs的cDNA序列,命名为SfruPBP1-SfruPBP4。4个SfruPBPs均含有完整的开放阅读框,所编码的蛋白具有性信息素结合蛋白的典型特征:N-端有信号肽、具有保守的6个半胱氨酸残基。系统进化分析显示SfruPBPs与斜纹夜蛾和海灰翅夜蛾PBPs的亲缘关系最近,且4个SfruPBPs被聚在不同的进化分支。4个SfruPBPs基因均由3个外显子和2个内含子组成,内含子插入位点高度保守。此外,4个SfruPBPs在草地贪夜蛾基因组上呈串联排列。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在成虫触角中特异性表达,其中SfruPBP1和SfruPBP2在雄成虫触角中的表达水平显著高于雌虫,而SfruPBP3在雌雄触角中的表达水平无显著差异。SfruPBP4特异性表达于雄成虫腹部。本研究结果为揭示草地贪夜蛾性信息素识别机制奠定了基础。     

斜纹夜蛾触角叶神经元及其对植物气味和性信息素的反应

【目的】探索斜纹夜蛾Spodoptera litura触角叶结构及其神经元对植物气味和性信息素的神经识别机制。【方法】利用共聚焦激光技术扫描斜纹夜蛾成虫触角叶结构,同时采用多通道电生理技术(multi-unit recording,MR)记录斜纹夜蛾触角叶对6种寄主植物气味化合物(苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、水杨醛、乙酸叶醇酯和己烯醛)及性信息素顺9反11十四碳二烯乙酸酯和顺9反12十四碳二烯乙酸酯的反应;并在风洞中测定分析斜纹夜蛾对上述化合物的定向行为反应。【结果】共聚焦激光扫描结果显示,雄性和雌性斜纹夜蛾触角叶内分别密集地分布有67和66个神经纤维球;而雌性斜纹夜蛾触角叶内的纤维球总体积和平均体积都高于雄性。负责识别和追踪性信息素的扩大型纤维球复合体(macroglomerular complex,MGC)只在雄性斜纹夜蛾触角叶内发现。MR试验结果显示斜纹夜蛾触角叶内神经元具有3种自发放电模式:稀疏放电(不规则的放电频率)、温和放电(宽而慢的放电频率)和密集放电(暴发性的放电频率)。同时,斜纹夜蛾触角叶神经元对所有刺激的气味表现出3种反应类型:兴奋性、抑制性和无反应。神经元对气味的兴奋性和抑制性反应以及无反应取决于刺激化合物的结构和浓度。雌虫的触角叶神经元对性信息素和单一的植物气味表现出很小的反应,而雄虫对两种性信息素以及苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛和水杨醛具有很强的兴奋性反应。斜纹夜蛾风洞试验也显示绝大部分的斜纹夜蛾雄虫都选择停留在性信息素和芳香族化合物上,这与MR的结果一致。【结论】神经元的反应强度和刺激化合物浓度之间的关系根据不同的神经元和刺激化合物而有所不同。在测试的浓度范围内,雄虫触角叶神经元对性信息素的反应强度随着浓度的增加而加强,但是除乙酸叶醇酯外,对其他植物气味的反应强度在测试的浓度范围内没有显著的变化。     

性信息素对斜纹夜蛾雄蛾嗅觉相关基因 abp,pbp 和 or 表达的影响

【目的】信息素是个体之间传递信息的重要分子,研究性信息素对斜纹夜蛾 Spodoptera litura 嗅觉相关基因表达的影响对于增加性信息素作用机理的认识及其应用有重要的意义。【方法】本研究通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术探究在性信息素刺激处理条件下,斜纹夜蛾成虫嗅觉相关基因 abp, pbp 和 or 表达水平的变化;利用性信息素在田间诱捕斜纹夜蛾雄蛾,并通过自动计数器记录每小时诱虫量,从而间接显示其交配行为的节律性。【结果】斜纹夜蛾雄虫触角中嗅觉相关基因abp, pbp 和 or 的表达具有节律特性。经性信息素化合物(Z9, Z11-14:OAc+Z9, Z12-14:OAc)刺激处理后,abp, pbp 和 or 表达量也发生了显著的改变。通过记录田间性信息素诱捕器在一天中不同时间段内诱捕的雄蛾数量,发现诱捕到的斜纹夜蛾也具有节律特性。【结论】基因表达水平上的节律特性可能与雄虫交配活动的节律相关联,说明性信息素处理也在一定程度上改变了其节律及其对性信息素的神经反应。这一结果也首次从基因水平证明性信息素的刺激处理提高了周缘神经系统对性信息素反应的敏感性,有助于我们理解性信息素作用的分子机理,对迷向及性诱和测报应用具有指导意义。     

甜菜夜蛾触角结合蛋白Ⅱ的cDNA克隆、 组织分布及配体结合特性分析

触角结合蛋白（antennal binding proteins, ABPs）是气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）的一个亚类, 推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题, 本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术, 克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触角结合蛋白Ⅱ基因（SexigABP2）的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ234486）。序列分析表明, 该基因开放阅读框长444 bp, 编码148个氨基酸, 具有OBPs典型的6个半胱氨酸位点; 其氨基酸序列和烟芽夜蛾Heliothis virescens的HvirABP2的一致性最高, 达72%。实时定量PCR分析显示, 该基因主要在触角中表达, 在喙、 足、 翅等组织中也有少量表达, 且在雌蛾触角及足中的表达量显著高于雄蛾。进一步对该基因进行原核表达和纯化, 利用荧光竞争结合实验测定了SexigABP2对35种气味物质的结合能力, 发现其对甜菜夜蛾性信息素组分(Z)-9-十四碳烯醇和植物挥发物法尼醇的结合能力较强, 结合常数分别为8.24 μmol/L和8.14 μmol/L。结合能力比较表明, SexigABP2对不饱和长碳链化合物较饱和短碳链化合物具有更强的结合能力; 在不饱和长碳链化合物中, 对醇类物质又较乙酸酯类物质具有更强的结合能力。结果提示SexigABP2可能参与了成虫对不饱和长碳链的植物挥发物的感受。     

荔枝蒂蛀虫信息素结合蛋白基因序列及表达分析

【目的】获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis 3个信息素结合蛋白(PBP)基因的全长序列,并分析序列和表达特征,为更好地利用性信息素防治该虫提供必要的基础。【方法】提取荔枝蒂蛀虫触角总RNA,利用转录组测序结果和RACE-PCR技术获得3个PBP基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用I-TASSER在线软件建立蛋白三维模型,用TM-align软件进行同源建模,用COACH软件推测蛋白的结合位点;用荧光定量PCR方法分析这3个基因在不同龄期(幼虫和蛹)和3日龄雌雄成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅]中的表达谱。【结果】从荔枝蒂蛀虫触角中克隆了3个PBP基因的全长序列,分别命名为Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3(Gen Bank登录号:MF093145,MF093146和MF093147)。序列分析结果表明,这3个基因的编码蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,并且Csin PBP1与紫色卷蛾Yponomeuta cagnagellus PBP的氨基酸序列一致性达72%,Csin PBP2与小菜蛾Plutella xylostella PBP1的氨基酸序列一致性达55%,Csin PBP3与水稻大螟Sesamia inferens PBP3的氨基酸序列一致性达39%。软件模拟分析表明,Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3蛋白的三维结构分别与家蚕Bombyx mori普通气味结合蛋白2(GOBP2)(PDB:2wc6A)、脐橙螟Amyetois transitetella PBP1(PDB:4inx A)和家蚕PBP(PDB:2p70A)相似度最高,分别预测得到10,7和8个结合位点。表达谱分析显示,3个基因均只在成虫触角中表达,在幼虫期和蛹期不表达,在成虫头(去除触角)、胸、腹、足和翅中也不表达,且在雄虫触角中的表达量分别是雌虫中表达量的1.94,28.19和32.94倍。【结论】获得荔枝蒂蛀虫3个PBP基因的全长序列,序列和表达分析结果提示这3个基因与雄虫感受性信息素有关。     

斜纹夜蛾的性选择行为

【目的】为了解斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius体重、日龄、交配经历及形态特征对其性选择行为的影响。【方法】本实验通过标记成虫后,采用观察记录的方法对其进行探究。【结果】斜纹夜蛾雌虫的体重对雄虫的性选择影响比较明显,体重较大雄虫优先选择体重较小的雌虫(71.43%),而体重较小雄虫喜欢选择体重较大的雌虫(72.00%)。体重较大和体重较小的雄虫都能获得体重较大雌虫的交配选择,但是体重较大者被选择的机会更大(70.00%),体重较小的雄虫不能获得体重较小雌虫的选择。雄虫仅选择1日龄的雌虫,而雌虫偏向选择3日龄和5日龄雄虫。交配经历影响斜纹夜蛾的性选择,未交配的雄虫优先选择未交配的雌虫(86.67%),但未交配的雌虫则优先选择已交配的雄虫(66.67%)。雄虫的形态特征(体长、翅展、腹长、复眼间距和触角长)对雌虫性选择有较明显的影响,但雌虫的形态特征除翅展的大小外,其体长、腹长、复眼间距和触角长等形态特征在雄虫选择进行交配中的作用不大。【结论】体重、日龄、交配经历及形态特征都能不同程度影响斜纹夜蛾的性选择行为。     

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。 本研究利用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta (Guenée)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列, 该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明, HassPBP2开放阅读框全长450 bp, 编码149个氨基酸残基, 推测编码蛋白的分子量为16.9 kD, 等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明, 该基因由3个外显子和2个内含子组成, 内含子的长度分别为90和261 bp。氨基酸序列联配分析表明, 此序列具有气味结合蛋白的典型特征, 与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间, 其中与棉铃虫Helicoverpa armigera PBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescens PBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示, HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达, 在蛹中期开始表达, 并一直持续到成虫中期, 且只在雌、雄成虫触角中表达。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

斜纹夜蛾的性选择行为

【目的】为了解斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius体重、日龄、交配经历及形态特征对其性选择行为的影响。【方法】本实验通过标记成虫后,采用观察记录的方法对其进行探究。【结果】斜纹夜蛾雌虫的体重对雄虫的性选择影响比较明显,体重较大雄虫优先选择体重较小的雌虫(71.43%),而体重较小雄虫喜欢选择体重较大的雌虫(72.00%)。体重较大和体重较小的雄虫都能获得体重较大雌虫的交配选择,但是体重较大者被选择的机会更大(70.00%),体重较小的雄虫不能获得体重较小雌虫的选择。雄虫仅选择1日龄的雌虫,而雌虫偏向选择3日龄和5日龄雄虫。交配经历影响斜纹夜蛾的性选择,未交配的雄虫优先选择未交配的雌虫(86.67%),但未交配的雌虫则优先选择已交配的雄虫(66.67%)。雄虫的形态特征(体长、翅展、腹长、复眼间距和触角长)对雌虫性选择有较明显的影响,但雌虫的形态特征除翅展的大小外,其体长、腹长、复眼间距和触角长等形态特征在雄虫选择进行交配中的作用不大。【结论】体重、日龄、交配经历及形态特征都能不同程度影响斜纹夜蛾的性选择行为。     

光肩星天牛性信息素结合蛋白AglaPBP1和AglaPBP2基因鉴定和表达分析

[目的]为了鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motsch.)的性信息素结合蛋白PBPs基因并明确其在雌雄成虫不同部位的表达差异。[方法]本文基于光肩星天牛触角转录组测序数据,通过blast比对得到2条PBPs基因片段,克隆测序得到2条PBPs基因的全序列,并进行生物信息学分析。采用Real-time PCR方法分析了2条PBPs基因在光肩星天牛雌雄成虫间的表达差异。[结果]克隆得到性信息素结合蛋白基因,命名为AglaPBP1(GenBank登录号:KX272639)和AglaPBP2(GenBank登录号:KX272640)。AglaPBP1开放阅读框长为411 bp,编码136个氨基酸,预测分子量为15.02 ku,等电点为4.22,AglaPBP2开放阅读框长为408 bp,编码135个氨基酸,预测分子量为15.00 ku,等电点为5.16。AglaPBP1和AglaPBP2都有完整的信号肽,分别位于1-21位氨基酸和1-19位氨基酸。AglaPBP1和AglaPBP2氨基酸序列中均有6个保守的半胱氨酸残基,与云斑天牛Batocerahorsfieldi(Hope)BhorPBP1和BhorPBP2的同源性分别为74%和49%。qPCR结果显示:AglaPBP1在雌雄虫触角、下颚须,以及雌虫足中均有的表达,且雌虫触角表达量高于雄虫。AglaPBP2仅在雄虫触角中显著表达,在雌雄虫的下颚须中也有少量表达。[结论]克隆获得了AglaPBP1和AglaPBP2基因序列,并明确了这两个基因在成虫不同部位的表达情况,为进一步研究其功能,从而为更好地了解PBPs在光肩星天牛嗅觉识别过程中的作用奠定了基础。     

梨小食心虫普通气味受体基因GmolOR20的克隆及表达分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta触角中的普通气味受体(odorant receptor, OR)OR20基因,明确其在不同发育期及成虫不同组织中的表达特征,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】根据梨小食心虫雌虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆梨小食心虫OR20基因的完整开放阅读框;采用qRT-PCR检测该基因在不同发育期(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)以及不同日龄(1, 3, 5和7日龄)成虫触角中的表达量。【结果】克隆获得梨小食心虫GmolOR20基因cDNA序列(GenBank登录号:MH898864)。该基因完整开放阅读框为1 284 bp,编码427个氨基酸,预测蛋白分子量为49.83 kD,理论等电点为8.57,具有7个跨膜结构域。序列比对和系统进化树结果表明,梨小食心虫GmolOR20与苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR15和豆荚小卷蛾Cydia nigricana CnigOR15亲缘关系较近,氨基酸序列一致性分别为87%和84%。发育表达模式结果显示,GmolOR20在不同发育时期均有表达,雌雄成虫中的表达量显著高于其他发育期的表达量(P<0.05),但雌、雄虫间的表达量差异不显著。组织表达模式结果表明,GmolOR20主要在成虫触角中高丰度表达,且雌虫触角中的表达量极显著高于雄虫触角中的表达量(P<0.01);GmolOR20在不同日龄成虫的触角中均有表达,且在1和3日龄成虫触角中的表达水平显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】根据GmolOR20基因的表达谱分析结果,推测GmolOR20可能参与梨小食心虫对植物挥发物和性信息素的识别。     

埃及伊蚊不同组织的基因共表达模式分析

【目的】利用权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)探索埃及伊蚊Aedes aegypti不同组织基因共表达模式。【方法】从NCBI SRA数据库中选择埃及伊蚊不同组织的转录组数据中具代表性的9种组织(雌雄成蚊的触角和脑,雌蚊的喙、下颚须和卵巢,雄成蚊的前足、中足、后足和腹部末端)的双端测序数据;经过缺失值移除以及方差计算后,筛选出方差最大的5 000个基因,利用R软件中WGCNA包建立埃及伊蚊成蚊不同组织的基因共表达网络并划分模块;然后利用clusterProfiler包对组织特异性模块内的基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)富集分析,并用Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选共表达模块内的hub基因。【结果】从埃及伊蚊成蚊不同组织中共鉴定出11个基因共表达模块,在雌蚊触角、喙、卵巢、下颚须以及雄蚊脑、腹部末端组织中各鉴定出1个特异性表达模块,雄蚊前足、中足和后足组织中无特异性表达模块。6个组织特异性表达模块内基因功能注释到组织生物学功能;其中,雌蚊触角特异性green模块内基因具有气味结合和嗅觉受体活性等功能;雌蚊喙特异性purple模块内基因具有丝氨酸型肽链内切酶活性和丝氨酸水解酶活性等功能;雄蚊脑特异性blue模块内基因在生物学过程调节、信号转导和神经系统过程等生物学过程中发挥主要作用。利用CytoHubba进一步鉴定出所选组织特异性共表达模块中具有高连通性的hub基因,包括AAEL010426, AAEL002896, AAEL002600, AAEL000961, AAEL007784和AAEL006429。【结论】本研究依据埃及伊蚊不同组织转录组数据,利用WGCNA方法发现了许多重要的基因共表达模块。本研究的结果为蚊虫基因共表达模式分析提供新思路和方法基础,对探究蚊虫不同组织特有的基因资源信息以及功能基因生物信息学研究有参考价值。     

松墨天牛是否存在雌性接触信息素?

将松墨天牛MonochamusalternatusHope的身体不同部位切除之后的交配试验显示,分别剪去头部、鞘翅以及前胸部后仍然可以正常交配,用雄虫的腹部代替雌虫的腹部后,仍然能够引起雄虫的交配趋势动作,但不能完成真正交配,因此推测雌性接触信息素如果存在,主要集中在雌虫身体后半部,尤其是中后胸部位。但是冻死后的雌虫不再引起雄虫的交配行为,而且冻死的雌虫与活雌虫同时放入培养皿中,雄虫喜欢与活雌虫交配,不选择冻死的雌虫,因此推测视觉在其松墨天牛的交配过程中扮演着重要的角色,而接触性信息素有可能并不存在。将雄虫的触角分别从第5~6节和第1节剪去的试验结果显示,雄虫仍然可以很快地找到雌虫,发生交配行为。这有2种可能的解释一是雄虫不仅仅靠触角来感受雌虫的接触信息素,头部下颚须和下唇须上或者足上也有可以感受信息素的感受器;二是雌虫不存在接触信息素,雄虫通过视觉就可以找到对方,完成交配过程。浸泡致死的雌虫不再引起雄虫的交配行为,并且将正己烷和乙醚的浓缩液滴加在浸泡致死的雌虫以及玻璃棒和鹅卵石的生测试验结果显示,都没有引起雄虫的交配行为。这进一步说明,松墨天牛可能并不存在体表接触信息素。性成熟后的松墨天牛雌雄成虫是靠衰弱寄主的强烈的挥发性气味聚集到寄主树干上,在树干这个较为狭小的环境里,有可能是通过视觉找到配偶,完成交配过程。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白GOBP1基因的表达定位分析

气味调控斜纹夜蛾Spodoptera litura（鳞翅目,夜蛾科）的交配和产卵行为,而嗅觉气味结合蛋白（OBP）是昆虫与外界环境进行化学信息交流中的一种重要蛋白。本研究基于已报道的斜纹夜蛾普通气味结合蛋白GOBP1基因cDNA序列（GenBank登录号为EF159978）设计引物,通过RT-PCR法分析了GOBP1 mRNA的组织特异性表达情况,并对GOBP1基因条带进行了克隆、测序和Blast比对。此外,再通过RNA原位杂交的方法进一步分析了GOBP1 mRNA在触角中的表达定位。结果表明:GOBP1只在斜纹夜蛾的触角组织中表达,而且GOBP1转录本较多分布于靠近嗅觉感受器即触角边缘部位。这些结果进一步说明GOBP1是斜纹夜蛾嗅觉过程中的重要蛋白,同时为深入研究GOBP1与其他蛋白的相互空间定位关系、GOBP1的功能等奠定了基础。     

薇甘菊颈盲蝽细胞色素P450 PmCYP4基因克隆及表达分析

【目的】薇甘菊颈盲蝽是入侵植物薇甘菊的天敌昆虫。CYP4家族基因在专食性昆虫与宿主植物的相互作用中发挥着极其重要的作用,探明其在不同部位的表达情况,可为薇甘菊生物控制提供科学依据。【方法】采用RACE技术克隆薇甘菊颈盲蝽CYP基因,实时荧光定量PCR检测其在不同部位的表达情况。【结果】PmCYP4C1基因全长1713 bp,其中ORF长1500 bp,共编码500个氨基酸,理论分子质量为57.44 ku,无信号肽;与其他昆虫CYP4家族基因的同源性大于40%,与温带臭虫CYP的亲缘关系最近。该基因在雌、雄虫各部位均有表达,且都是足部的表达量明显地高于其他部位;雌、雄虫的表达差异在于雄虫翅膀中的表达量明显地高于触角和残体,但在雌虫中这3个部位的表达量无显著差异,且雄虫翅膀中的表达量显著地高于雌虫,是其2.37倍。【结论】薇甘菊颈盲蝽PmCYP4基因除参与代谢有毒物质外,其主要功能可能是编码与薇甘菊颈盲蝽运动相关的酶。     

绿盲蝽气味受体基因AlucOR40的克隆及功能研究

【目的】从绿盲蝽Apolygus lucorum触角中克隆气味受体基因Aluc OR40,研究该气味受体基因在绿盲蝽不同组织中的表达水平,然后对该基因的功能进行研究,为理解绿盲蝽的嗅觉识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到气味受体基因Aluc OR40的全长序列。用半定量RT-PCR研究该基因在雌雄虫不同组织中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达该基因,并结合双电极电压钳检测了该气味受体对60种气味分子包括绿盲蝽性信息素组分和植物挥发物的反应。然后,利用触角电位技术测定羽化后3 d的绿盲蝽成虫对Aluc OR40的气味配体的触角电位反应。【结果】克隆了Aluc OR40(Gen Bank登录号:KU886190)。Aluc OR40编码398个氨基酸,蛋白具有7个跨膜结构域,N末端位于胞内,C端位于细胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。半定量RT-PCR的结果显示,Aluc OR40在触角中特异表达,且在雄虫触角中的表达水平高于雌虫。双电极电压钳记录结果显示,Aluc OR40只对反-2-己烯醇一种气味分子具有特异反应。EAG实验结果表明,羽化后3 d的绿盲蝽雌雄虫都对反-2-己烯醇有反应,且雄虫触角的EAG反应显著高于雌虫。【结论】结果提示Aluc OR40参与了绿盲蝽对反-2-己烯醇的识别过程,推测其在绿盲蝽交配过程中雄虫对雌虫的识别中发挥作用。     

草地贪夜蛾热激蛋白基因SfHsp90的克隆及在高低温和UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本研究旨在探索草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda响应高低温和UV-A胁迫的分子机制。【方法】通过RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾热激蛋白基因Hsp90,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-qPCR技术检测草地贪夜蛾Hsp90基因在不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(去除触角和复眼的头、胸、腹、触角、复眼、足、翅、中肠、精巢和卵巢)及在不同时长(0, 30, 60, 90, 120和150 min)高温(36℃)、低温(4℃)和UV-A胁迫下成虫中的相对表达量。【结果】克隆获得草地贪夜蛾Hsp90基因,命名为SfHsp90(GenBank登录号:MN832694),该基因开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸,编码蛋白质相对分子量为82.52 kD,等电点(pI)为5.01,C末端序列含保守基序EEVD,说明该蛋白为胞质型热激蛋白。系统进化分析结果表明,昆虫Hsp90高度保守。发育表达模式显示SfHsp90在草地贪夜蛾1龄幼虫中表达量最高;组织表达模式显示,SfHsp90在草地贪夜蛾雌雄成虫的触角、复眼和去除触角和复眼的头中的表达量显著高于在其他组织中的。高低温胁迫对草地贪夜蛾SfHsp90表达具有明显的诱导作用,36℃胁迫下,SfHsp90表达量显著高于对照,且随着处理时间的延长,在雄成虫中表达量先上升后下降,在60 min时达到最高值,在雌成虫中表达量随处理时间延长逐渐升高;4℃胁迫下,在雄成虫中表达量随着处理时间的延长先上升后下降,在30 min时表达量达到峰值,在雌成虫中表达量随着处理时间延长逐渐上升;随着UV-A照射时间的延长,在雌雄成虫中表达量先上升后下降,90 min时在雄成虫中表达量达到最高值,60 min时在雌成虫中表达量达到最高值。【结论】草地贪夜蛾SfHsp90基因在高低温和UV-A胁迫下的差异表达说明该基因在草地贪夜蛾响应环境胁迫的分子机制中发挥重要作用。     

斜纹夜蛾嗅觉受体基因Ⅱ的表达谱分析

气味调控斜纹夜蛾Spodoptera litura的觅食、 交配和产卵等行为, 而嗅觉受体（olfactory receptor, OR）作为气味的直接受体, 是嗅觉神经信号产生的起点, 是嗅觉信息的编码及信号的传递通路的重要组成部分。本研究通过RT-PCR和Western blot技术, 对斜纹夜蛾嗅觉受体基因Ⅱ（Spodoptera litura olfactory receptor gene Ⅱ, SlitOR2）（GenBank登录号： DQ845292）的组织特异性和不同发育阶段表达情况进行分析鉴定。半定量RT-PCR研究结果表明, SlitOR2主要在成虫期的触角中表达, 其他部位和发育期未检测到表达。Western blot鉴定结果表明SlitOR2主要在成虫触角表达, 与半定量RT-PCR结果基本一致。但在成虫足、 头和中期蛹中也看到有微量蛋白表达。可能是与目的蛋白大小类似的其他非特异性蛋白条带, 也可能是该蛋白在成虫足部、 头部和中期蛹中有微量表达, 因为足部的跗节和头部的口喙也分布有少量的嗅觉感器。目的条带单一清晰, 表明制备的多肽抗体特异性较好, 可以用于后续相关实验。