人细小病毒B19 VP1u多克隆抗体的制备及其保守区外N端氨基酸对sPLA2活性影响的初步研究

【目的】制备人细小病毒B19-VP1u的多克隆抗体,探究VP1u多克隆抗体及其保守区外N端氨基酸对病毒磷脂酶A2活性的影响。【方法】首先通过分子克隆方法构建相应原核表达载体;利用原核表达系统纯化含MBP标签的VP1u全长及N端系列截短突变融合蛋白;接着免疫新西兰大白兔制备全长VP1u蛋白的多克隆抗体;最后利用磷脂酶A2活性检测试剂盒检测了纯化蛋白的磷脂酶A2活性。【结果】Western blot及免疫荧光实验证实制备的多克隆抗体具有较高的特异性;磷脂酶A2活性检测发现全长VP1u-MBP融合蛋白具有一定的活性,该活性可以被VP1u的抗体抑制;N端保守区外截短系列蛋白的酶活检测发现,N端截掉12个氨基酸时酶活降低53%,截掉67个氨基酸时酶活性几乎完全丧失。【结论】首次发现VP1u保守区外N端氨基酸,尤其是第12个氨基酸前的区域以及第22-67个氨基酸之间的区域,对sPLA2活性的保持具有重要意义,推测该区域可能对维持正常的蛋白构象起重要的作用;而其特异性多克隆抗体的制备也为进一步研究B19病毒VP1u在病毒复制周期的作用奠定基础。     

水稻条纹叶枯病毒对灰飞虱生物学特性及若干生理生化特性的影响

【目的】为明确水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus,RSV)侵染对灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)生长发育的影响,本文比较研究了带毒与无毒灰飞虱发育历期及寿命、卵巢发育及体内相关酶活力等生物学特征和生理生化指标间的差异。【方法】利用单管饲养法,比较分析了带毒与无毒灰飞虱若虫历期与成虫寿命;通过解剖灰飞虱卵巢,观察并统计不同卵子级别与数量,研究携带RSV病毒对灰飞虱卵巢发育的影响;利用多种酶活力测定方法,比较带毒与无毒灰飞虱若虫期5种相关酶活力的差异。【结果】无毒灰飞虱雌、雄若虫历期分别为(16.30±0.33)d和(15.62±0.21)d;带毒灰飞虱雌、雄若虫历期分别为(19.08±0.43)d和(18.50±0.58)d,表明RSV侵染显著延缓了灰飞虱若虫的生长发育(t-test,P0.001);而无毒灰飞虱雌、雄成虫寿命分别为(10.74±0.81)d和(14.46±1.34)d;带毒灰飞虱雌、雄成虫寿命分别为(9.09±1.27)d和(13.55±2.38)d,表明RSV侵染对灰飞虱成虫发育没有显著影响。解剖羽化后的灰飞虱卵巢经统计分析后,发现RSV侵染后灰飞虱的卵巢发育及卵子发生并未受到明显影响。对发育至3龄若虫后12、24、120 h的无毒与带毒灰飞虱进行相关的酶活力测定,包括保护酶系超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、解毒酶系谷胱甘肽-S转移酶GST和乙酰胆碱酯酶Ach E,发现RSV侵染对灰飞虱体内相关生化酶活力大小无明显影响,但可改变酶活力的变化趋势。【结论】RSV侵染显著延长灰飞虱若虫发育历期,但对成虫的寿命和卵巢发育无明显影响,对体内保护、解毒等相关代谢酶活力大小没有显著影响,但却可以改变酶活力的变化趋势,推测RSV与灰飞虱不存在典型的互惠互利关系。     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK 1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开放阅读框长2379 bp,编码792个氨基酸;TBK 1开放阅读框长1551 bp,编码516个氨基酸。两个基因编码的蛋白都具有1个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和1个泛素折叠结构域。RT-PCR结果表明,IKKα和TBK 1在无毒灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中均有表达。qRT-PCR分析结果表明,IKKα和TBK 1在RSV侵染后的灰飞虱各个龄期及成虫不同组织中的表达水平与其在无毒灰飞虱中的表达量之间存在明显差异。进一步将RSV侵染后的灰飞虱3龄若虫中的IKKα和TBK 1干扰后,带毒灰飞虱中的RSV含量显著上升。【结论】本研究结果表明,NF-κB信号途径中的两个重要基因IKKα和TBK 1在灰飞虱中广泛表达,且在灰飞虱抵御RSV的侵入过程中可能具有重要功能。这些结果为今后进一步深入研究NF-κB免疫通路在灰飞虱抗病毒中的功能提供了丰富的基础信息。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

褐飞虱吞蛋白的基因克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】探析吞蛋白(endophilin)在褐飞虱Nilaparvata lugens生长繁殖过程中的作用。【方法】克隆褐飞虱吞蛋白基因,并进行生物信息学分析;在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达褐飞虱吞蛋白基因,融合蛋白经Ni柱亲和层析法纯化后,免疫新西兰兔子,获得相应的多克隆抗体;将所得的抗体用于检测褐飞虱卵巢中吞蛋白的表达和定位。【结果】克隆得到褐飞虱两个吞蛋白基因endophilin A(Endo A)和endophilin B(Endo B),GenBank登录号分别为KY126096和KY126095,分别编码387个和352个氨基酸,都含有吞蛋白典型的BAR结构域和SH3结构域,但它们在结构上存在差异。ELISA和Western blot检测结果表明,制备的兔抗血清效价达1∶1 000 000,并表现出较好特异性。将获得的抗体应用于免疫荧光实验表明,Endo A和Endo B蛋白在褐飞虱卵巢中普遍表达,在卵巢滤泡细胞的细胞间隙、细胞膜、细胞质中广泛分布,而且与脂类物质的分布模式类似,与正在侵入褐飞虱卵巢的类酵母共生菌共定位。【结论】获得了褐飞虱吞蛋白基因Endo A和Endo B序列,并明确了其生物信息学特征,成功制备了Endo A和Endo B多克隆抗体,分析了Endo A和Endo B在褐飞虱卵巢中的表达情况,认为其可能与褐飞虱卵巢发育和成熟以及类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。这些结果为进一步研究Endo A和Endo B在褐飞虱中的生物学功能奠定了基础。     

杆状病毒AcMNPV vp39基因的克隆、表达与抗体制备

目的:构建苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedro virus,AcMNPV)VP39的原核表达载体,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体。方法:用PCR方法扩增vp39基因,并将其克隆至pET-21a( )上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用割胶回收的方法纯化融合蛋白,纯化的融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,Western blot检测抗体活性。结果:构建了pET-VP39原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导超量表达了一个与预期理论值相符的约为40kDa的融合蛋白。对制备的抗体进行免疫印迹分析表明该抗血清能与感染苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。结论:获得了兔抗AcMNPV-VP39多克隆抗体,为进一步深入研究VP39在病毒侵染过程中与宿主因子的相互作用提供了检测工具。     

呼吸道合胞病毒F1片段膜外区的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用大肠杆菌表达人呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的F1片段膜外区,制备其多克隆抗体,为RSV的相关研究提供检测抗体。方法:采用全基因合成方法合成RSV的F1片段膜外区基因,构建带有His-Tag的原核表达载体p ET28a-F1-His,转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,37℃、IPTG诱导表达,超声波破菌,离心收集包涵体,溶解后经镍离子亲和层析方法进行纯化。纯化的蛋白经SDS-PAGE回收后切胶研磨,免疫大耳白兔,制备RSV的F蛋白多抗血清,采用Western印迹检测血清特异性。结果:构建的p ET28a-F1-His重组质粒在大肠杆菌中表达目的蛋白,其相对分子质量约44×10~3,与理论值一致,免疫后获得的多克隆抗体可特异性识别RSV F蛋白。结论:制备了RSV F蛋白的兔源多克隆抗体,为进一步研究RSV F蛋白疫苗奠定了基础。     

不同CO_2浓度条件下灰飞虱体内RSV的定量检测

灰飞虱的群体带毒率及体内条纹病毒(rice stripe virus,RSV)的准确检测是预测水稻条纹叶枯病在CO2浓度升高背景下能否大发生的重要参考依据之一。本研究应用quali-fiedRT-PCR(qRT-PCR)测定不同CO2浓度条件下灰飞虱体内的RSV含量。结果表明:在试验的3个CO2浓度梯度(370、470和570μl.L-1)下,470μl.L-1的CO2浓度最适合RSV在灰飞虱体内的增殖,此方法与现已普遍应用的酶联免疫检测法(enzyme-linkedi mmu-nosorbnent assay,ELISA)和斑点免疫结合检测法(dotimmunobinding assay,DIBA)相比,具有快速、灵敏和特异性强的优点,且不需制备抗血清,适于普及应用。     

下调烟粉虱MED隐种BtabCSP6表达对番茄黄化曲叶病毒传播的影响

【目的】番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是对农业生产造成威胁的主要病毒之一,自然条件下通过媒介昆虫烟粉虱Bemisia tabaci传播。已有研究表明烟粉虱雌成虫比雄成虫具有更强的获毒与传毒能力。本研究旨在探明烟粉虱化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因BtabCSP6表达对病毒传播的影响,为控制病毒发生寻找新途径。【方法】使用TYLCV侵染性克隆方法获得带毒番茄植株,微虫笼收集不带毒烟粉虱MED隐种成虫固定在感染TYLCV的番茄植株叶片获毒48 h;利用RT-qPCR技术测定分别取食感染和未感染TYLCV番茄植株的烟粉虱MED隐种雌雄成虫体内BtabCSP1-8基因表达量变化;通过饲喂法利用RNAi对烟粉虱MED隐种雌成虫BtabCSP6基因进行干扰48 h后饲喂TYLCV感染的番茄植株,测定烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率。【结果】RT-qPCR检测结果表明,与未侵染的烟粉虱MED隐种雌成虫相比,侵染TYLCV的雌成虫体内BtabCSP3和BtabCSP6基因的表达量变化最为显著。同样地,在侵染TYLCV的雄成虫体内,BtabCSP4和BtabCSP6表达量的变化最为明显。饲喂dsBtabCSP6 48 h后,烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6表达量降低;取食感染TYLCV番茄植株不同时间烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和不同数量雌成虫对未感染TYLCV的番茄植株的传毒率与对照相比均显著降低。【结论】下调烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6基因的表达,可显著降低烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率,说明BtabCSP6可能影响TYLCV传播。     

家蚕细胞中过表达家蚕核型多角体病毒核衣壳蛋白VP39抑制BmNPV的增殖

【目的】家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）核衣壳蛋白VP39为病毒装配所必需。本研究旨在初探VP39在病毒侵染家蚕细胞过程中的功能及特征,以期为家蚕抗病毒研究提供研究基础。【方法】本研究通过构建原核表达载体,诱导原核表达得到多克隆抗体,以Western blot验证VP39表达时相;构建真核表达载体,转染细胞后以免疫荧光手段观测VP39表达定位及影响病毒增殖现象。【结果】制备了VP39多克隆抗体。VP39在病毒感染后大量定位于家蚕细胞核,部分定位于胞质,而过表达的VP39定位于家蚕细胞胞质;过表达VP39后抑制BmNPV感染家蚕细胞。【结论】在BmN-SWU1细胞中过表达VP39会影响BmNPV的扩散,导致BmNPV感染细胞数目大量减少。该结果为VP39调控宿主与病毒的相互作用提供了新的思路。     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。     

棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定

【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子,参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体,明确HaAP-4基因的时空表达谱,初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段,将其克隆至pET-28a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,经IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA,转染棉铃虫Ha细胞,通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒,在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白,目的蛋白大小约为55 kD,经纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体,通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性,ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示,HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明,HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达,且在中肠和头部具有高表达,而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现,HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响,HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4,并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示,在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。     

核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位

【目的】明确核桃举肢蛾 Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(AhetPBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成cDNA,设计简并引物进行RT-PCR获得cDNA片段,然后利用RACE技术获得 AhetPBP2全长cDNA序列。将去除信号肽序列的AhetPBP2进行原核表达,重组蛋白经镍柱纯化并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体作为一抗对核桃举肢蛾触角进行免疫组化分析。【结果】AhetPBP2基因cDNA序列全长923 bp,开放阅读框504 bp,共编码167个氨基酸,分子量为19.26 kD,等电点为5.47。1 mmol/L IPTG诱导10 h获得可溶性重组蛋白,Western blot结果表明重组蛋白诱导表达成功,ELISA检测显示抗体效价为1:1 024 000。免疫荧光定位结果显示核桃举肢蛾成虫触角部分感器被AhetPBP2抗体标记。【结论】核桃举肢蛾成虫触角的部分感器中可能存在AhetPBP2,推测该部分感器具有感受性信息素的功能。     

卡尼鄂拉蜂锌转运蛋白-7相似蛋白（ZnT-7-like）的基因克隆、 抗体制备及差异表达

【目的】本研究旨在克隆卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica锌转运蛋白 7相似蛋白（zinc transporter 7-like, ZnT-7-like）基因, 制备ZnT-7-like多克隆抗体, 了解该基因在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的差异表达情况。【方法】运用RT PCR法从卡尼鄂拉蜂王浆腺总RNA中扩增ZnT-7-like基因, 进行生物信息学分析, 为避开跨膜结构的干扰, 选择克隆其部分序列（273 bp）作为多肽免疫序列。将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中诱导表达获得融合蛋白, 然后将融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性, 最后采用实时荧光定量RT-PCR以及Western blot技术检测该基因在不同日龄成虫王浆腺中的相对表达量。【结果】克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 大小为1 065 bp。SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达; 制备的多克隆抗体效价高达1∶64 000, 且具有很高的特异性。ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂5个日龄成虫中的转录情况存在较大差异, 表现为3日龄成虫中的表达量极显著高于其他日龄（P<0.01）, 12日龄表达量最低, 其他日龄间表达量两两差异显著(P<0.05)或极显著（P<0.01）; ZnT-7-like蛋白表达与转录水平基本一致。【结论】成功克隆了卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 制备了兔抗蜂ZnT-7-like多克隆抗体, 并在转录和翻译两个水平上测定了ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的相对表达量。这些结果为深入研究卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的功能奠定了基础。     

JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的制备pET-32a(+)-VP1蛋白的多克隆抗体。方法用纯化后的VP1蛋白分4次免疫兔子,颈动脉插管法取血,制得多克隆抗体。结果用ELISA法和Western blot鉴定多克隆抗体的效价得1?320000。该抗体可以用Western blot法检测出59 kD左右的VP1蛋白。结论成功制备高效价的JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体。     

单纯疱疹病毒2型衣壳支架蛋白ICP35原核表达载体的构建及其表达特性分析

本研究旨在构建单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)衣壳支架蛋白ICP35的原核表达载体,并分析其在HSV-2增殖中的表达特性。以HSV-2基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSV-2 ICP35的编码基因UL26.5,并克隆至原核表达载体pET-32a(＋),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,将纯化的重组ICP35免疫家兔后获得抗体,采用免疫荧光检测ICP35在HSV-2增殖中的表达特性。结果显示,HSV-2 UL26.5基因的PCR产物大小约为1 065 bp,原核表达重组蛋白的相对分子质量约为6.3×10⁴,免疫家兔的血清抗体可特异性识别HSV-2 ICP35。免疫荧光检测结果显示,HSV-2 ICP35可在感染后8 h出现于细胞核周围,12 h表达量进一步增加并向细胞核内聚集,16 h后在细胞核、细胞质内均可检测到聚集成斑点状的衣壳支架蛋白。结果表明,HSV-2 ICP35原核表达载体的成功构建及对其在HSV-2增殖中表达特性的分析,将为研究UL26.5基因的功能、蛋白相互作用、病毒与宿主的相互作用及筛选药物靶标等奠定基础。     

凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价

凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1 ∶ 243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。     

小反刍兽疫病毒Ｍ基因的截短表达及 多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。