粪肠球菌噬菌体vB_E. faecalis_IME196的生物学特性及其全基因组分析

【目的】从医院污水中分离一株能裂解多耐药粪肠球菌的噬菌体,分析该噬菌体的生物学特性,并进行全基因组测序和分析,为治疗和控制多耐药粪肠球菌感染提供基础。【方法】以耐药粪肠球菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,双层平板法检测噬菌体效价、最佳感染复数(MOI)和一步生长曲线,纯化后负染法电镜观察噬菌体形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体全基因组,酶切处理后琼脂糖凝胶电泳分析,使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后进行噬菌体全基因组序列组装、注释、进化分析和比较分析。【结果】分离到一株粪肠球菌噬菌体,命名为v B_E.faecalis_IME196(IME196);其最佳感染复数为0.01,一步生长曲线显示IME196的潜伏期为30 min,暴发量为50 PFU,电镜观察该噬菌体为长尾噬菌体,结合BLASTp分析确定其属于尾病毒目长尾噬菌体科,基因测序表明,噬菌体IME196核酸类型为DNA,基因组全长为38 895 bp,G+C含量为33.9%。【结论】分离鉴定一株粪肠球菌噬菌体,进行了全基因组测序和分析,为以后预防和控制粪肠球菌的感染提供了一个新的途径,为噬菌体治疗多重耐药细菌奠定了基础。     

分枝杆菌噬菌体Guo1环状基因组特征及生物学特性分析

【目的】初步研究分枝杆菌噬菌体Guo1环状基因组特征及生物学特性。【方法】采用鸟枪法和重叠群组装策略完成Guo1全基因组测序;使用DNAStar、tRNAscan-SE、Promoter predictions、TRF、Glimmer、BLAST软件分别对噬菌体的一般基因组学特征、tRNA、启动子、串联重复序列和编码基因进行分析;运用BLAST软件检索与Guo1基因组相似的噬菌体并构建系统进化树,推断Guo1的分群;测定最佳感染复数、一步生长曲线以及对紫外线、氯仿、酒精、温度、pH的敏感性。【结果】噬菌体Guo1的基因组为全长40 086 nt的环状双链DNA,属于G群分枝杆菌噬菌体;含有59个推定基因,7个启动子序列和3个串联重复序列;Guo1对紫外线有较强抵抗性,对酒精、氯仿和高温敏感,最适温度为37 °C,最适pH为7.0,最佳感染复数为0.01,潜伏期120 min,裂解期120 min,裂解量为47个。【结论】Guo1是首次发现的具有环状双链DNA结构的G群分枝杆菌噬菌体,完成了Guo1的全基因组测序,并初步分析了Guo1的基因组特征和生物学特性。     

屎肠球菌噬菌体vB_EfaS_29生物学特性及基因组分析

【背景】随着屎肠球菌耐药性越来越严重,亟需筛选获得新的、裂解效率高且遗传背景清晰的裂解性噬菌体,丰富噬菌体资源,为噬菌体疗法提供可用的菌株。【目的】从江苏省南京市西岗奶牛场粪便样品中分离出一株裂解性屎肠球菌噬菌体,研究其生物学特性及分析基因组学特征。【方法】通过双层平板法对其进行纯化,观察噬菌斑特征,透射电镜观察噬菌体形态,测定一步生长曲线、pH耐受性、温度耐受性以及最佳感染复数,对噬菌体进行全基因组测序及遗传进化分析。【结果】分离并纯化的一株裂解性屎肠球菌噬菌体命名为vB_EfaS_29,其噬菌斑圆形透亮,外周无晕环。该噬菌体头部呈二十面体,头部直径约52.4 nm,尾长约157.1 nm,为长尾噬菌体科。该噬菌体的最佳感染复数为0.1,最高耐受温度为70℃左右,当pH值在6.0-9.0时其效价稳定。一步生长曲线表明,其潜伏期为10 min,暴发期约为50 min,暴发量为80。基因组全长41 014 bp,GC含量为34.99%,共有63个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其中36个被注释出已知基因,基因组中不含毒力基因、耐药基因及整合基因。进化分析显示以裂解酶编码氨基酸为靶标对比,该噬菌体与GenBank上的粪肠球菌噬菌体vB_EfaS_DELF1相似性大于99%,但是以噬菌体衣壳蛋白编码氨基酸为靶标比对发现,该噬菌体肠球菌与其他噬菌体遗传距离均较远。【结论】分离出一株裂解性屎肠球菌噬菌体,对其进行生物学特性及基因组分析,为噬菌体研究和应用提供理论依据及研究基础。     

一株肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析

【背景】随着抗生素的广泛使用甚至滥用,细菌耐药性问题日益显著,利用噬菌体治疗耐药致病菌的方法重新开始被人们关注。【目的】对一株烈性肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnP_IME279进行生物学特性研究及生物信息学分析。【方法】以一株多重耐药的肺炎克雷伯菌为宿主菌,从医院污水中分离噬菌体,应用双层平板法检测噬菌体效价、最佳感染复数(Optimal MOI)、一步生长曲线以及裂解谱,纯化后通过透射电镜观察噬菌体形态;应用蛋白酶K/SDS法提取噬菌体全基因组,使用Illumina MiSeq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析。【结果】分离到一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnP_IME279;其最佳感染复数为0.1,一步生长曲线显示潜伏期为20 min,平均裂解量140 PFU/cell,电镜观察显示该噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组测序表明,噬菌体基因组全长为42 518 bp,(G+C)mol%含量为59.3%。BLASTn比对结果表明,该噬菌体与目前已知噬菌体的相似性较低,基因组仅70%区域与已知噬菌体有同源性。构建噬菌体主要衣壳蛋白的基因进化树,分析了噬菌体IME279与其他短尾科噬菌体的进化关系,结果表明该噬菌体是短尾科噬菌体的一名新成员。【结论】分离鉴定了一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体,进行了生物学特性、全基因组测序和生物信息学分析,为研究肺炎克雷伯菌噬菌体与宿主之间的相互作用关系以及治疗多重耐药细菌感染奠定了基础。     

一株屎肠球菌烈性噬菌体的分离鉴定及基因组测序分析

【背景】屎肠球菌为ESKAPE(由屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属六大超级细菌的拉丁学名首字母组成)病原体之一,对多种抗菌药物具有耐药性,严重威胁全球人类健康,被世界卫生组织列入亟须研发新抗菌药的病原体名单。【目的】分离针对屎肠球菌的烈性噬菌体,测定其基本生物学特性并进行基因组测序分析,为屎肠球菌噬菌体疗法提供原料。【方法】从牧场污水中分离筛选出一株烈性屎肠球菌噬菌体,命名为Enterococcus phage 1A11,通过透射电镜观察噬菌体的形态,测定其最佳感染复数、一步生长曲线和裂解谱,并进行全基因组的测序和分析,以阐释该噬菌体的基本生物学特性。【结果】电镜下可观察到屎肠球菌噬菌体1A11具有典型的正二十面体头部结构和较长的尾部结构,属于有尾病毒目长尾病毒科,而且测得其最佳感染复数为0.01,裂解周期为70 min,潜伏期为30 min,暴发期为40 min,并特异性地对部分屎肠球菌产生裂解作用。噬菌体1A11的基因组大小为42 750 bp,GC含量为34.71%,含有70个推定的开放阅读框(open reading frame, O...     

一株强裂解性大肠杆菌T1样噬菌体新成员的分离与鉴定

【目的】自然界中噬菌体种类繁多,其裂菌功能在针对细菌耐药方面具有潜在应用价值。不同噬菌体也呈现出显著的基因多样性及宿主特异性。从上海某猪场仔猪肠内容物样品中分离、纯化大肠杆菌的裂解性噬菌体,分析其生物学特性和病毒学特征,为探索应用噬菌体治疗细菌性感染提供研究材料。【方法】采用双层琼脂平板法分离、纯化噬菌体,观察噬菌斑特征,通过电镜观察噬菌体形态特征,测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线和生物学特性,进行噬菌体全基因组测序和遗传进化分析。【结果】分离、纯化获得一株能高效裂解大肠杆菌K-12菌株的噬菌体,命名为v B_Eco S_SH2(SH2),噬菌斑呈圆形、大而透明、边缘整齐。电镜观察SH2的头部呈二十面体立体对称,尾部较长。噬菌体的潜伏期为10 min,暴发期为60 min,裂解量高达121 PFU/感染细胞,其最佳感染复数为0.1。基因组测序和比对结果表明,SH2的核酸类型为ds DNA,基因组全长为49 088 bp,G+C%含量为45%,Gen Bank登录号为KY985004,结合电镜观察及BLASTp分析,确定其属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科成员。同源性及进化分析表明,该噬菌体为大肠杆菌T1样噬菌体的新成员。【结论】分离鉴定了一株裂解效率极高的大肠杆菌T1样噬菌体,并确认其为T1样噬菌体新成员,为研究大肠杆菌噬菌体及其抗菌应用提供了新的实验材料。     

一株铅黄肠球菌噬菌体的生物学特性和全基因组分析

【目的】铅黄肠球菌是医源感染的机会致病菌,可引起危及生命的败血症、脑膜炎等,但针对其噬菌体的研究尚属空白。噬菌体作为细菌病毒,具有宿主特异性。本研究首次分离到可培养的铅黄肠球菌烈性噬菌体,对其基因组序列的分析和其他特征研究为进一步探讨噬菌体与宿主的作用机制及治疗应用提供参考。【方法】噬菌体Ecf_virus_SZ01以健康人粪便中分离的铅黄肠球菌(DO55)作为宿主菌,分离自深圳市南山区未经处理的生活污水样本,利用透射电镜观察噬菌体形态并对其生物学特征和基因组特点进行研究。【结果】透射电镜显示,噬菌体Ecf_virus_SZ01头部直径约为106 nm,尾部直径约为150 nm,尾长且无伸缩性尾鞘,属长尾噬菌体科;该噬菌体的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线显示,潜伏期约为30 min,每个受感染细胞产生子代的平均数量为50 PFU/cell;抑菌曲线显示MOI=0.01时对宿主菌具有很好的抑制效果;宿主特异性强,不能实现跨属侵染;测序结果显示其基因组为dsDNA,长度为59 409 bp,GC含量为43.2%;该噬菌体共有102个开放阅读框,BLASTn比对显示该噬菌体与NCBI数据库中其他噬菌体相似性极低。【结论】首次分离到宿主为铅黄肠球菌的噬菌体,具有潜伏期短、裂解能力强、宿主专一的特征,基因组与数据库中现有噬菌体相比十分新颖,并对其生物学特性和基因组进行了分析。     

雄烯二酮高产菌新金分枝杆菌MN4的全基因组测序及序列分析北大核心CSCD

【目的】新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)MN4是1株经诱变育种获得的高产雄烯二酮,并且能够耐受高浓度底物植物甾醇的突变菌株。为深入研究MN4菌株耐底物的机制及雄烯二酮的生物合成途径,有必要解析MN4菌株的全基因组序列信息。【方法】本研究采用高通量测序技术对MN4进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组装、基因预测与功能注释、COG聚类分析以及次级代谢产物合成基因簇预测等。【结果】新金分枝杆菌MN4基因组装获得33个Contigs,整个基因组大小为5.39 Mb,GC含量为66.9%,编码4920个蛋白基因,序列提交至Gen Bank数据库,登录号为JXYZ00000000。【结论】本研究首次报道了1株高产雄烯二酮菌株MN4的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,初步解析了该菌株降解植物甾醇生产雄烯二酮的关键基因,将为MN4的功能基因组学研究及相关次级代谢产物的生物合成途径与异源表达研究提供基础。     

一株新型牛源肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定

【背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种广泛分布于环境中的重要致病菌,该菌较高的耐药性致其在养殖业中治疗较为困难。【目的】分离一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体,对分离株进行生物学特性鉴定和基因组学分析。【方法】使用双层平板法从四川省某奶牛场中分离、纯化出一株裂解性噬菌体,测定其裂解谱、热稳定性、酸碱耐受度、最佳感染复数及一步生长曲线等生物学特性,并进行全基因组的测序及注释分析。【结果】得到一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体vB_Kpn_B01,该噬菌体拥有透明且无晕环的噬菌斑,热稳定性较高,在极酸或极碱环境下不进行裂解活动,特异性较强,属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。vB_Kpn_B01全基因组大小为113 227 bp,GC含量为47.97%。注释结果显示噬菌体拥有149个编码序列和25个tRNAs,不含耐药基因及毒力基因。通过噬菌体的进化树分析发现,该噬菌体为Sugarlandvirus。【结论】vB_Kpn_B01拥有高效的生长特性和对不利环境的低耐受性,拥有裂解宿主菌的必备基因,并不含耐药基因及毒力基因,具有应用于畜牧业中防治多重耐药细菌的潜力。     

林麝源铜绿假单胞菌噬菌体vB＿PaeM＿PAMD02的生物学特性与全基因组序列分析

【背景】圈养林麝一半以上的死亡是由铜绿假单胞菌引起的化脓性疾病导致。另外,由于细菌的抗性增加,噬菌体是继抗生素后的另一抗菌选择。【目的】以分离自病死林麝肺脏的铜绿假单胞菌为宿主菌分离一株噬菌体,对其进行生物学特性、全基因组序列分析与体内抑菌试验。【方法】通过双层平板法分离纯化一株裂解性噬菌体,测定其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、最适生长pH等生物学特性,通过电镜观察其具体形态,进行全基因组测序与序列分析,并进行小鼠体内抑菌试验。【结果】分离到一株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体并命名为vB＿PaeM＿PAMD02,该噬菌体具有透明且边缘清晰无晕环的噬菌斑,其裂解谱较窄,最佳感染复数为0.1,裂解潜伏期为40 min,裂解暴发量较高,热稳定性较高,可耐受弱碱环境。其全基因组大小为66 264 bp,GC含量为55.59%,序列注释结果显示该噬菌体具有92个开放阅读框,不含毒力与耐药基因,属于肌尾噬菌体科。小鼠体内抑菌试验结果显示了PAMD02对其宿主菌良好的抑菌效果。【结论】本研究分离的噬菌体PAMD02有较高的裂解效率,对不利环境有较好的耐受性,不含毒力基因与耐药基因,具有应用...     

一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体分离鉴定和生物学特性研究及全基因组分析

[背景]噬菌体具有特定的杀菌能力,对生态和细菌的进化具有重要影响。近年来由于多重耐药细菌的全球出现,噬菌体疗法逐渐引起了人们的关注。[目的]对一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体vB_KpnP_IME308进行生物学特性研究、测序和比较基因组学的分析。[方法]以一株从临床分离到的肺炎克雷伯菌为宿主菌分离噬菌体,应用双层平板法进行噬菌体最佳感染复数(optimal multiplicity of infection)、一步生长曲线(one-step growth curve)、温度以及pH敏感性实验测定,纯化噬菌体并通过透射电镜观察噬菌体形态;应用标准的苯酚-氯仿提取方案提取噬菌体全基因组,使用Illumina MiSeq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析。[结果]分离到一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnP_IME308;其最佳感染复数为0.001,一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为80 min,平均裂解量330PFU/cell;噬菌体vB_KpnP_IME308在4-50℃和pH 5.0-10.0范围内稳定;电镜观察该噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组测序结果表明,噬菌体基因组全长为43 091bp,(G+C)mol%含量为53.9%,(A+T)mol%含量为46.1%。BLASTn比对结果表明,该噬菌体与目前已知噬菌体基因组仅84%区域有相似性。噬菌体进化树结果表明该噬菌体属于Autographivirinae亚科的Drulisvirus属的成员。[结论]从医院污水中分离鉴定了一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,表征并分析了噬菌体全基因组序列,这些结果均表明该噬菌体具有开发为抗肺炎克雷伯菌制剂的潜力,为噬菌体治疗多重耐药细菌感染奠定了基础。     

一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究

目的:利用临床耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体,为应用噬菌体治疗耐药粪肠球菌感染提供基础。方法:利用噬菌斑实验分离噬菌体并观察噬菌斑形态;双层平板培养法测定噬菌体效价、最佳感染复数及一步生长曲线;负染法电镜观察噬菌体形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体基因组,酶切处理后琼脂糖凝胶电泳分析。结果:分离出一株噬菌体IME-EF1,该噬菌体能裂解多株临床分离的粪肠球菌;电镜观察呈蝌蚪形,最佳感染复数为1;通过绘制一步生长曲线,证明该噬菌体感染后的潜伏期为25 min,爆发期为35 min,裂解量为60 pfu。结论:研究结果表明利用临床分离的耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体是可行的,有望为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法奠定基础。     

Complete Genome Sequence of Bacteriophage BC-611 Specifically Infecting Enterococcus faecalis Strain NP-10011

Enterococcus faecalis is an opportunistic pathogen that causes serious infections in humans and animals and is also an important bacterium for dairy and probiotic supplement production. Therefore, bacteriophages infecting E. faecalis may be useful for phage therapy against multidrug-resistant strains or may threaten industrial fermentation. We isolated a virulent Siphoviridae bacteriophage, BC-611, specifically infecting E. faecalis strain NP-10011 but not infecting other E. faecalis strains or other enterococci. Although the genome sequence of BC-611 resembled that of enterococcal bacteriophage SAP6, BC-611 was marked by its narrow host specificity.     

Complete Genome of Pseudomonas aeruginosa Phage PA26

PA26, a novel lytic bacteriophage infecting Pseudomonas aeruginosa, was isolated, and the whole genome was sequenced. It was found to belong to the myoviridae by an electron microscopic observation. It had a linear double-stranded DNA genome of 72,321 bp. Genomic analysis showed that it resembled another Pseudomonas phage, LIT1.     

鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35的 分离及全基因组分析

摘要：目的 通过分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体并进行遗传信息分析,为今后噬菌体用于治疗鲍曼不动杆菌引起的感染提供依据。方法 以鲍曼不动杆菌临床分离株为宿主菌,从医院污水中分离鲍曼不动杆菌噬菌体并进行纯化、电镜观察形态特征、提取噬菌体DNA,进行全基因组测序,分析全基因组的结构特征,比较基因组分析其进化关系。结果 分离到鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35,电镜观察显示,该噬菌体属于有尾噬菌体目肌尾病毒科。基因组全长44 885 bp,G＋C含量为37.95%,含有83个开放阅读框,其中22个编码序列可预测其功能,61个编码序列为未知基因。噬菌体LZ35的基因组与鲍曼不动杆菌噬菌体IME-AB2和YMC-13-01-C62具有很高的同源性（分别为97%和99%）,与鲍曼不动杆菌噬菌体YMC11/12/R1215的进化关系最近。结论 以鲍曼不动杆菌临床分离株为宿主菌,分离到鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体LZ35,明确了其形态和基因组特征,为防治噬菌体疗法奠定基础。     

Characterization of lytic enzyme open reading frame 9 (ORF9) derived from Enterococcus faecalis bacteriophage phiEF24C

In bacteriophage (phage) therapy against Gram-positive bacteria, such as Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, and Enterococcus faecalis, members of a genus of SPO1-like viruses are typically employed because of their extreme virulence and broad host spectrum. Phage φEF24C, which is a SPO1-like virus infecting E. faecalis, has previously been characterized as a therapeutic phage candidate. In addition to the phage itself, phage endolysin is also recognized as an effective antimicrobial agent. In this study, a putative endolysin gene (orf9) of E. faecalis phage φEF24C was analyzed in silico, and its activity was characterized using the recombinant form. First, bioinformatics analysis predicted that the open reading frame 9 (ORF9) protein is N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase. Second, bacteriolytic and bactericidal activities of ORF9 against E. faecalis were confirmed by zymography, decrease of peptidoglycan turbidity, decrease of the viable count, and morphological analysis of ORF9-treated cells. Third, ORF9 did not appear to require Zn(2+) ions for its activity, contrary to the bioinformatics prediction of a Zn(2+) ion requirement. Fourth, the lytic spectrum was from 97.1% (34 out of 35 strains, including vancomycin-resistant strains) of E. faecalis strains to 60% (6 out of 10 strains) of Enterococcus faecium strains. Fifth, N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase activity of ORF9 was confirmed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and the subsequent MALDI-postsource decay (PSD) analyses. Finally, functional analysis using N- or C-terminally deleted ORF9 mutants suggested that a complete ORF9 molecule is essential for its activity. These results suggested that ORF9 is an endolysin of phage φEF24C and can be a therapeutic alternative to antibiotics.     

一株新型旱獭源性宽谱大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组分析

[目的]分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。[方法]以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。[结果]从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5) nm,尾部长度为(115±5) nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5-9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133 882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae) Avunavirus属的新型噬菌体。[结论]从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。