植物冠瘿的诱导培养和植株再生

用根癌土壤杆菌S-1、702和C-58从向日葵胚轴、烟草茎和茎髓,胡萝卜根及马铃薯块茎诱发并建立了冠瘿株系。观察了它们的生长,畸胎瘤发生。在诱发后数月内有些冠瘿株发生明显变化。向日葵冠瘿株在诱发七个月后外形和生长速度发生了变化。由S-1菌株诱发的马铃薯块茎畸胎瘤发生在诱发初期,但702菌株诱发的两株烟草无组织冠瘿株在诱发后155天左右才出现畸胎瘤,不同菌株诱发的两个烟草冠瘿株对植物激素的反应不同。获得了分化程度不同的一组畸瘤胎。用植物激素研究了冠瘿瘤的逆转。两个胡萝卜和两个烟草冠瘿株系分别得到再生植株。所有冠瘿株包括畸胎瘤产nopaline,由烟草畸胎瘤的再生植株也测出了nopaline。     

烟草原生质体再生的愈伤组织与冠瘿组织分化的比较

普通烟草(Nicotiana tabacum L.)原生质体培养成植株的研究国内外已有不少报道。我们研究了红花大金元品种的烟草叶肉原生质体培养成植株的条件,并考虑到由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱导的烟草冠瘿及其畸胎瘤与正常细胞有显著差别,它们在不加任何激素的培养基上细胞能继续分裂,增殖。如果冠瘿及畸胎瘤组织与原生质体再生的愈伤组织在分化芽和根方面也有差别,那末,利用它与正常细胞融合后,有可能提供更多的筛选杂种的条件,我们对这两种细胞在同样条件下分化芽和根的情况作了比较研究。     

冠瘿组织中Nopaline合酶的定量研究——Ⅰ.不同植物冠瘿株中Nopaline合酶的定量比较

本文发展了一种根据NADPH消耗定量测定冠瘿组织粗酶提取液中nopaline合酶活性的方法。对于含nopaline型Ti质粒的土壤根癌杆菌菌株透发的马铃薯、向日葵、烟草和胡萝卜冠瘿系来说,出于不存在酶反应的促进剂或抑制剂,粗酶提取液中nopaline合酶的活性能够反映体内存在的此酶的酶量。用这个方法测定了四株土壤根癌杆菌菌株诱发的十六株植物冠瘿系的nopaline合酶活性,由不同菌株诱发的所有胡萝卜,烟草冠瘿素包括单细胞克隆的烟草冠瘿系,以DNA为单位的此酶量明显地低于向日葵和马铃薯冠瘿系。由此推测,不同宿主植物中nopaline合酶量的差异很大程度上取决于宿主植物本身。通过Ti质粒把外源基因导入不同植物可能有不同的命运。     

发根农杆菌转化大豆的研究

本文利用发根农杆菌感染大豆不同外植体,在成熟胚靠近子叶节部位诱导产生毛状根。经冠瘿碱检测表明,毛状根及由此产生的愈伤组织均有甘露碱存在,说明Ri质粒的T-DNA已整合到大豆的转化根及愈伤组织中。转化根再生实验表明,在含NAA和IAA8mg/L的MS培养基上得到不定根的分化,MS和B_3培养基及6％蔗糖对转化丛生芽的诱导有利。转化的丛生芽在MS基本培养基上进一步长成小植株。     

植物的序列转化:意想不到的问题

尽管当前植物遗传工程方法通常只涉及将单个理想基因引入植物体,但分子生物学家已预见到将来人们可能会利用多基因来转化植物。这可通过用多个T-DNA协同转化植物或通过序列转化——各自选择不同的标记的一系列转化步骤来完成。然而,奥地利科学院的M.A.Matzke和同事研究发现,烟草植物的序列转化可能导致意想不到的问题。他们用含有一卡那霉素抗性基因的T-DNA(T-DNA-Ⅰ)通过根癌土壤杆菌转化烟草植株。在第二次转化中,他们将具有潮霉素抗性基因的T-DNA(T-DNA-Ⅱ)引入含有     

葡萄根癌土壤杆菌诱导的葡萄、毛叶曼陀罗冠瘿瘤的离体培养和植株再生

生化Ⅲ型葡萄根癌土壤杆菌MI3-2、BS33-6等菌株含有致瘤的Ti质粒。用章鱼碱菌株MI3-2、MI14-1、MS32-1、MI22-1及胭脂碱菌株BS33-6、BS33-7、从葡萄试管苗的茎诱导出冠瘿瘤。脱菌的葡萄冠瘿组织能在无外源植物激素供给的MS培养基继代生长,并合成章鱼碱或胭脂碱。章鱼碱冠瘿组织疏松、白色或淡黄色;胭脂碱冠瘿组织硬脆,深绿色,表面有许多小突起。两种冠瘿组织都未能诱导再生植株。 胭脂碱菌株BS33-6能诱导毛叶曼陀罗产生畸胎瘤,这种无菌畸胎瘤组织在无植物激素的培养基内,培养1个月能分化出植株。     

向日葵Ti T—DNA转化系的原生质体培养和细胞培养

根癌农杆菌离体感染向日葵子叶、下胚轴外植体形成的Ti T-DNA转化组织在激素条件下长期继代培养后,用来进行原生质体培养和细胞培养。适于B6S3转化系和T37转化系原生质体培养的培养基分别为附加不同激素和糖类的C81V和DPD培养基。用液体浅层法培养3～5天时,原生质体开始分裂。10天后形成细胞团。B6S3转化系还可直接从原生质体产生原胚状结构。转化系的细胞克隆均保持着激素自主型生长特性和冠瘿碱合成酶合成特性。     

组织培养引起的遗传变异

1902年Haberlandt首次对植物的叶肉细胞进行了培养,到目前为止,植物组织和细胞培养研究已有九十年的历史。在二十年代对器官培养,特别是在离体根培养方面获得了一些进展;三十年代从形成层诱导产生了愈伤组织,离体根可以长期培养;四十年代发现了植物激素在芽形成中的作用,White于1943年在烟草培养物中发现了再生植株;五十年代到六十年代发展较快,Steward(1958)和Reinert(1959)差不多同时发现从培养的胡萝卜根细胞产生出一种与胚状相似的结构,并观察到由这种结构长成完整的植株;七十年代后,开始了植物原     

从圆辣椒不定芽再生植株成功

茨城县园艺试验场从圆辣椒的种子高效诱导出不定芽,开发能再生植株的培养系获得成功,在4月千叶大学园艺系召开的第81次日本育种学会上发表。利用组织培养诱导圓辣椒不定芽特别困难,过去报道了使用植物激素的一种的不定芽诱导法。但是,诱导率相当低,几乎不能从不定芽再生植株。使用茨城县园艺试验场开发的培养系,不定芽的诱导率在80%以上。由不定芽长成的苗伸长率在60%以上。成功的关键是不加植物激素。其他方面与普通培养系相同。预计在茨城县园艺试验场将该培养系用于向圆辣椒导入烟草花叶病毒(TMV)的编码蛋白基因。该     

致瘤农杆菌对龙葵的致瘤作用及其T-DNA的转移

本文介绍采用9种致瘤农杆菌处理龙葵幼小植株,获得大量的畸胎瘤,并分化出健壮的幼苗,这些幼苗成长后能正常开花结实。将由畸胎瘤上形成的枝条上的叶片和幼茎,放在没有附加激素的培养基上培养,能分化出幼苗。经测定这些幼苗内含有胭脂碱,从而证实了致瘤农杆菌的Ti质粒上的T-DNA成功地整合到植物细胞中,为进一步研究特殊基因的转移创造有利的条件。     

植物基因工程研究的潜在受体——甘蓝

本文报道了3个致瘤农杆菌的菌株对4个甘蓝品种的致瘤作用。并从甘蓝的畸胎瘤的幼苗叶片在无激素的MS培养基上直接分化出幼苗和A 208菌株诱导的报春甘蓝瘤组织上幼苗叶片诱导出愈伤组织并分化出大量不定芽,再分化的幼苗和不定芽均含有胭脂碱。同时观察了畸胎瘤上分化的幼苗长成植株、开花结实和整个生长期间胭脂碱含量的变化。说明了甘蓝是研究基因工程的潜在的受体材料。     

植物组织中冠瘿碱合成酶活性检测的一种简便有效方法

由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染引起的植物冠瘿瘤(crown gall)细胞除具激素自养性生长特性外,还具有一类特殊的基因产物,即冠瘿碱(opines)~[3]。常见的冠瘿碱主要有章鱼碱(octopine)和胭脂碱(nopaline)等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶(oct-opine synthase),或叫Lysopine脱氢酶[D-(+)-lysopine dehydrogenase,简称LpDH]。催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline     

烟草毛状根多倍体诱导及其植株再生

为了提高烟草的烟碱含量,采用发根农杆菌遗传转化和人工染色体加倍技术,进行了烟草毛状根及其多倍体诱导、植株再生及其烟碱含量测定。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染烟草叶片外植体8 d后产生白色毛状根,15 d后所有叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在烟草毛状根基因组中整合并得到表达。烟草毛状根多倍体诱导的最适条件为0.1%的秋水仙素溶液处理36 h,其多倍体诱导率为64.71%。经秋水仙素加倍的烟草毛状根多倍体植株再生的最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。与对照(二倍体非转化植株)相比,烟草二倍体毛状根再生植株的顶端优势减弱,腋芽增多,叶片变窄;而烟草毛状根多倍体再生植株茎更粗,节间变短,叶色更深,叶片的宽度和厚度均较对照明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实,所获得的烟草毛状根多倍体再生植株为四倍体,其根尖细胞染色体数约为4n=96。盆栽实验表明,烟草二倍体毛状根植株和多倍体毛状根再生植株比对照植株延迟约21 d开花。GC-MS检测表明,烟草毛状根多倍体再生植株的烟碱含量比对照及二倍体毛状根再生植株显著提高,分别约为对照及二倍体毛状根再生植株的6.90倍和4.57倍。     

发根土壤杆菌Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究

以发根土壤杆菌Ｒｉ质粒介导,对载体ｐＢＴＣ－８上的Ｔ－ＤＮＡ转化黄瓜进行了初步研究。采用黄瓜的各种不同外植体片断与土壤直菌共培养的方法,诱导出具有典型毛状根特性的转化根,转化根经诱导培养形成愈伤组织,冠瘿碱检测表明,转化根及愈伤组织含有农杆碱和甘露碱。愈伤组织进一步分化培养再生出完整植株。再生植株表现卡那霉素抗性。     

罗汉果茎段离体培养研究

罗汉果茎段培养在MS基本培养基中,研究植物激素对器官形成的影响,试验结果表明细胞分裂素BA促进芽的形成和增殖;而KT则有利于根的形成,却抑制芽的增殖,BA和IBA配合使用,对茎段形成芽有增效作用。通过继代培养,能繁殖大量绿苗,这揭示出同一块离体茎组织培养出许多小植株的可能,将嫩梢转入含有NAA0.2毫克/升的1/2MS培养基中,能诱导生根,形成完整小植株,试管苗成功地移栽田间,并已开始开花结果,     

火百合花丝组织培养器官形成的细胞组织学研究

以火百合花丝节段为外植体,接种在附加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培养基上,诱导出愈伤组织及器官。经细胞组织学观察表明,细胞启动、愈伤组织形成及器官再生皆发生于外植体形态学下端的切口边缘及内方,而形态学上端的细胞自始至终未启动。器官发生的途径是通过愈伤组织间接产生,有的愈伤组织团单独形成芽或根,而有的愈伤组织团则同时分别从表面形成芽,内部形成根,通过维管组织连接成完整的植株。     

烟草未受精中央细胞及其它胚囊细胞的离体分裂

自70年代中期以来,未传粉子房和胚珠的离体培养已在多种植物中取得成功,得到的单倍体植株来源于胶囊中的卵细胞、助细胞以及反足细胞。而分离的未受精胚囊及其成员细胞的离体培养虽屡经尝试,迄今只有Kranz等诱导了玉米未受精卵细胞分裂形成小愈伤组织,至于中央细胞与其它雌配子体细胞则无离体分裂的报道。本文报道大叶烟草未受精中央细胞首次培养成细胞团及其它胚囊细胞启动离体分裂的实验结果。     

硝酸银与脱落酸相配合影响菜心离体培养之植株再生方式的组织学研究

菜心带子叶的子叶柄在培养基中是否添加ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ可导致两种不同的植株再生方式：添加ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ时由外植体直接出芽,而不加ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ则植株再生经过愈伤组织阶段再分化成芽。培养１—３ｄ,子叶柄切口端之皮层及维管束的薄壁细胞开始启动,细胞迅速分裂而形成分生细胞团和少量愈伤组织。第４天,在不含ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ的培养基上,分生细胞团则形成根原基进而发育成根;或者去分化形成愈伤组织。在这种条件下,只有少数芽原基可由培养１５ｄ后的愈伤组织再分化产生．在含ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ的培养基上,分生细胞旺盛增殖而形成大量分生细胞团,并由这种分生细胞团直接形成大量的芽原基．１０ｄ左右即可产生为数众多的丛生不定芽．ＡｇＮＯ３与ＡＢＡ相配合抑制了不定根及愈伤组织的形成和生长,促进大量增生的分生细胞团直接分化为不定芽的芽原基．     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

蒲公英离体根段的不定芽分化

在室温与保湿条件下,蒲公英离体根段能从形成层或髓部分化出不定芽,分化率在63％左右。不定芽总是发生在根段顶端,显示出极性现象,推测该极性现象与顶端集积细胞激动素有关。试验表明,外植体是影响下定芽分化的决定因素,氧、湿度(水)、温度、营养是必需因素,不需要光。但不定芽健康地长成植株则需要光。