Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立

目的:建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-790 1细胞适配子.方法:体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库 ,通过优化PCR扩 增条件,利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃 癌SGC-7901细胞的特异性适配子.将最后一轮筛选产物克隆、测序并用相关软件分析适配子 序列的一级结构和二级结构.结果:经12轮SELEX筛选,ssDNA文库与SGC- 7901细胞的亲和力由0.16上升至1.14,表明特异性适配子得到逐步富集.22个克隆子测序, 有4个序列完全一致,二级结构预测茎环可能是适配子与胃癌细胞作用的结构基础.结论:成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法.     

细胞SELEX技术用于胰腺癌细胞特异性适配体的筛选及鉴定

细胞SELEX是目前常用的筛选细胞特异性适配体的技术。胰腺癌细胞特异性适配体在胰腺癌的诊断和治疗中有巨大的应用潜力。本研究拟通过该技术获得特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体,并对所筛选的适配体进行功能鉴定。本研究以胰腺癌PANC-1细胞为正筛细胞,正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7为负筛细胞,通过磁珠法细胞SELEX技术进行筛选。经过12轮筛选,对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序,获得2条适配体Apt-5和Apt-12。流式细胞术检测发现,适配体Apt-5和Apt-12可特异性识别PANC-1细胞,其Kd值分别为8.27±2.10 nmol/L和8.88±2.51 nmol/L,Kd值均处于纳摩尔级别。通过RNA结构预测,2条适配体的二级结构均为茎-环结构。细胞免疫荧光验证了适配体的结合部位为细胞膜表面。本研究表明,通过磁珠法细胞SELEX技术,成功获得可特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体。该适配体有望成为胰腺癌诊断和治疗中的特异性分子靶向剂。     

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。     

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA适配体筛选

目的:筛选获得特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的单链DNA适配体。方法:合成全长81 nt,中间含39个随机序列的单链寡核苷酸(ss DNA)文库,运用指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选获得GPC1适配体;酶联免疫吸附分析法(ELISA)实验确定候选适配体与GPC1蛋白的亲和力,流式细胞术确定候选适配体与2种GPC1高表达细胞系(胰腺癌Panc-1细胞和工具细胞Luc-ZR-75-1~(GPC1))的结合特异性。结果:经过10轮SELEX筛选获得#9适配体,ELISA分析其亲和力为44±0.69 nmol/L,流式细胞术结果表明其与胰腺癌Panc-1细胞和Luc-ZR-75-1~(GPC1)细胞的阳性结合率分别为44.69%和51.44%。结论:筛选获得与GPC1蛋白有较高亲和力、与表达GPC1细胞系特异结合的ss DNA适配体。     

人FcγRI特异性核酸适配体的体外筛选及鉴定北大核心CSCD

人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。     

适配体传感器在微生物检测中的应用

适配体是一类特异的核酸序列,具有靶分子广、特异性强、稳定等优点.该类核酸分子在体外通过SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术(系统进化的指数富集技术)鉴定和筛选得到.相对于抗体,适配体为诊断和检测分析系统中的识别配基提供了另一个选择.适配体生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合,从而检测目标化合物的分析装置.适配体生物传感器在微生物检测方面具有分析速度快、灵敏度高、专一性强等特点,在微生物检测中显示出良好的应用前景.介绍了适配体、SELEX流程以及适配体传感器,综述了适配体传感器在微生物检测中的应用.     

人FcγRI特异性核酸适配体的体外筛选及鉴定

人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。     

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术（whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX）,从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数（Kd）测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其Kd值为549.2 ± 147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到 40条非癌核酸适配体序列和 41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的 4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为 90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。