假单胞菌生物被膜核心胞外多糖生物合成系统研究进展

胞外多糖是假单胞菌生物被膜的重要组成部分,能增强菌体对外界环境、抗菌剂和宿主防御的耐受性.假单胞菌能产生3种与生物被膜形成密切相关的核心胞外多糖:褐藻胶、Psl和Pel,它们在细菌细胞中的合成和转运分别依赖对应的褐藻胶、Psl和Pel生物合成系统.因此,本综述系统全面地总结了假单胞菌3种胞外多糖生物合成系统结构生物学的...     

细菌生物被膜核心胞外多糖靶向水解酶的生物信息挖掘北大核心

【目的】胞外多糖是生物被膜不可或缺的重要成分,在细菌致病和耐药过程中发挥着重要作用。运用酶制剂针对生物被膜的核心胞外多糖进行靶向清除,能够从根本上破坏细菌生物被膜的核心骨架,有助于战胜细菌生物被膜导致的危害。【方法】本研究针对常见致病菌生物被膜核心胞外多糖Pel、Psl、褐藻胶、N-乙酰氨基葡萄糖(Poly-β(1,6)-N-acetyl-D-glucosamine,PNAG)和纤维素,基于NCBI数据库中丰富的基因序列信息,筛选靶向生物被膜核心胞外多糖的水解酶,进一步运用phyre2、SWISS-MODEL等生物信息工具,分析了这些水解酶的理化性质、遗传进化、功能域及三维结构。【结果】筛选获得了153个靶向生物被膜核心胞外多糖的水解酶及其序列信息。其中,靶向Pel胞外多糖的水解酶共30个,属于糖苷水解酶114家族(glycoside-hydrolase family GH114);靶向Psl胞外多糖的水解酶共25个,属于糖苷水解酶超家族(glyco_hydro super family);靶向褐藻胶胞外多糖的水解酶共33个,属于褐藻胶裂解酶超家族(Alg Lyase superfamily);靶向PNAG胞外多糖的水解酶共30个,属于糖苷水解酶13家族(glycoside-hydrolase family GH13);靶向纤维素胞外多糖的水解酶共35个,属于糖苷水解酶8家族(glycosyl hydrolases family GH8)。【结论】这些水解酶菌具备靶向瓦解生物被膜核心胞外多糖的潜力,亟待进一步开发与应用。本研究提供了迄今为止最为全面的生物被膜核心胞外多糖水解酶序列组成及生物信息,为生物被膜的精准预防和靶向控制奠定扎实的数据基础。     

绿原酸通过增强RsmA的表达抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成

铜绿假单胞菌是常见的人类条件致病菌,其生物被膜的形成会增强菌体的耐药性。已有文献报道绿原酸可抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成,本研究在此基础上主要探究了其对全局性次级代谢调控系统Gac-Rsm表达的影响。结果显示,绿原酸可抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的能力,降低胞外总多糖合成量,但关键胞外多糖psl的合成酶基因pslA转录未受影响,还可增强Gac-Rsm系统中关键调控因子RsmA的表达水平,降低细胞内关键信使分子环二鸟苷酸(cyclic dimeric guanosine monophosphate,c-di-GMP)水平。结果表明,绿原酸可通过增强RsmA的表达来抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。     

去垢剂在膜蛋白研究中的应用

去垢剂是同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性分子,能够使脂膜解体释放膜蛋白,并在溶液中为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境,维持和保护膜蛋白的疏水跨膜结构,在膜蛋白的结构和功能研究中有重要的意义。去垢剂的双极性和理化特性,如临界胶束浓度能够极大影响去垢剂和膜蛋白间的相互作用。在膜蛋白研究中,需要充分利用去垢剂的结构和特性:一方面,需要利用去垢剂代替脂质分子支持和稳定去膜状态下膜蛋白的结构和功能;另一方面,需要控制去垢剂和膜蛋白的相互作用,以满足膜蛋白结构研究如蛋白质结晶试验的要求。简要介绍了去垢剂在膜蛋白研究中的最新应用进展,涉及去垢剂在膜蛋白离体表达、分离和纯化、以及结构研究中的应用。     

发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖提取物抑制单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成能力的研究

【目的】筛选能有效抑制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)形成生物被膜的乳酸菌,分析其活性成分并进行功能表征。【方法】采用结晶紫染色法筛选抑制LM形成生物被膜的不同乳酸菌提取物;通过酸中和、蛋白酶处理及热处理,推测抑制生物被膜活性物质以胞外多糖(extracellular crude polysaccharide,ECP)为主;乙醇沉淀法提取目标乳酸菌分离株胞外粗多糖,分析其抑制生物被膜形成活性和对LM生长的影响;运用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscopy,LCSM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观察胞外粗多糖对生物被膜细胞形态和结构的影响。【结果】发酵乳杆菌CSC-19发酵上清液对1516-2LM生物被膜的抑制率为81.7%;经热和蛋白酶处理后,发酵上清抑制生物被膜形成的活性未发生显著变化(P>0.05),表明发酵上清液中抑制生物被膜形成的物质可能为胞外多糖;在不抑制LM生长的条件下所提取的胞外粗多糖抑制生物被膜形成能力具有浓度依赖性。激光共聚焦扫描显微镜和扫描电子显微镜结果显示,胞外粗多糖显著抑制了生物被膜的形成能力,生物被膜三维、有组织的蜂窝状结构被破坏,仅有少量的粘附细胞分散于细胞爬片表面。【结论】发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖能有效抑制LM生物被膜的形成,有望应用于高效防控该菌污染食品。     

膜转运蛋白的功能性超表达和纯化

膜转运蛋白结构和功能的研究是功能膜蛋白质组研究中的一个重要内容,而大量蛋白质的分离纯化是进行蛋白质的结构和功能研究的基础.目前,结构和功能膜蛋白质组学相关研究的瓶颈,在于不能有效地超量表达和纯化具有生物活性的膜转运蛋白.影响膜转运蛋白超量表达和纯化的关键因素,包括目标蛋白的拓扑学结构分析和去垢剂的选择.进行膜转运蛋白拓扑学结构的分析,对于构建用于活体表达的重组膜转运蛋白具有指导意义.去垢剂能够稳定去膜状态的膜蛋白,在膜转运蛋白的离体表达和亲和纯化以及包涵体的处理过程中具有重要的作用.本文就目前功能膜蛋白质组学研究中所涉及的有关膜转运蛋白功能性超表达和分离纯化策略及关键技术作一简述.     

分析超速离心技术研究膜蛋白TmrAB

去垢剂在膜蛋白的提取纯化过程中起到必要的作用,对膜蛋白的聚合状态、结晶条件以及理化性质等方面都有较大影响.分析超速离心技术(analytical ultracentrifuge,AUC)通过测定溶液中膜蛋白-去垢剂复合物在离心场中的沉降运动轨迹,可以分析获得其沉降系数、摩尔质量、流体力学半径、结合常数等水力学和热力学性质,进而判断膜蛋白-去垢剂复合物的均一性及聚合状态.本文以嗜热菌来源的ATP结合转运蛋白(ABC transporter)TmrAB作为研究对象,利用分析超速离心技术结合分子排阻层析和冷冻电镜负染技术,研究其均一性、聚合状态以及去垢剂与膜蛋白的摩尔比.结果显示,在8倍临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)的DDM条件下,TmrAB性质均一,并以异二聚体的单体形式存在,DDM与Tmr AB的摩尔比为116∶1.本研究表明,分析超速离心技术是一种测定膜蛋白分子质量、研究膜蛋白聚合状态的可靠手段.     

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.     

靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜的定向蛋白投放技术

【目的】随着合成生物学的发展,通过在细菌体内设计合成复杂、多功能的基因线路进行靶向治疗已经取得巨大进展。虽然这种使用细菌作为治疗传递系统,选择性地在体内释放有效治疗成分的方式具有极大优势,但是如何使细菌在代谢负荷增加较低的情况下有效地分泌功能蛋白并发挥作用依旧是一个难题。【方法】针对这一难题,本研究提供了一种新的策略,即以细菌中广泛存在的蛋白类杀菌素和丝状噬菌体等相关编码基因作为生物模块,通过对铜绿假单胞菌的这些内源生物模块的重新编排和组装,构建了一种能在特定条件下裂解并投放功能蛋白的工程菌。为了评价工程菌中构建的生物模块能否工作,本研究选择胞外多糖水解酶PelA和PslG作为工程菌投放的功能蛋白,以此构建了工程菌PAO1102。通过对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏实验、抑制形成实验以及抗生素耐药性实验,检验PAO1102对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏和预防效果。【结果】与对照组相比,工程菌PAO1102的处理可以显著破坏已形成的生物被膜并抑制生物被膜的形成,同时还可显著增强生物被膜中的细菌对妥布霉素的敏感性,且这些功能主要通过外界Pf4丝状噬菌体侵染并使工程菌裂解而释放功能蛋白这一途径实现的。【结论】本研究所构建的工程菌可以作为一种微生物工具,用于靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜。在后续的研究中可根据不同的需求,在工程菌中表达不同的功能基因并实现功能蛋白的定向投放,从而执行不同的生物学功能。     

铜绿假单胞菌黏附素蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)黏附素(adhesin)基因,表达纯化黏附素蛋白和获得多克隆抗体。[方法]设计特异性PCR引物,以铜绿假单胞菌DNA为模板,PCR法扩增铜绿假单胞菌黏附素基因,并将其进行双酶切后连接到表达载体pET28a,将重组质粒pET28a-adhesin转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,然后通过亲和层析进行纯化。再利用各种生物信息学软件分析该蛋白的生物学特性。将adhesin蛋白免疫小鼠,并获得了高浓度的多克隆抗体。[结果]显示成功得到了重组质粒pET28a-adhesin,并通过亲和层析得到重组adhesin蛋白。Adhesin的α-螺旋含量为46.37%,无规卷曲的含量为35.96%,β片层的含量为17.67%。模拟得到了adhesin蛋白的三级结构。该蛋白是一个跨膜蛋白,具有两个跨膜区。Adhesin蛋白具有良好的免疫原性,获得的抗血清效价高于1:5120。[结论]纯化得到了重组adhesin及其抗血清,为研究该蛋白的功能提供了实验基础。