真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶（aconitase,Aco）是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸. 真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1（c-Aco）和定位在线粒体的顺乌头酸酶2（m-Aco）.检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变. 顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性. 该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱. 同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.     

白地霉的氧化代谢

1．自地霍完整静息幼胞氧化乙醇、乙酸、丙酮酸及草酰乙酸的速度很高,对其他三羧酸循环各酸如：琥珀酸、延胡索酸、a-酮戊二酸、苹果酸、柠檬酸、顺岛头酸及异柠檬酸也能氧化,但速度甚低。 2．在白地霉无细胞提取液中测出了三羧酸循环中以下各种酶活力：柠檬酸精合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺岛头酸酶、a-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、草酰乙酸羧化酶等,并间接得知有乙酸激活酶及L-谷氨酸脱氢酶存在。 3．在白地霉无捆胞提取液中测出了乙醛酸循环的两个关键的酶皂口异柠檬酸酶及苹果酸合成酶。 4．由以上结果可知白地霉可利用三羧酸循环及乙醛酸循环作为末端呼吸途径。     

‘鸭梨’ב京白梨’杂交后代果实有机酸积累差异及相关酶活性的研究

该研究以‘鸭梨’ב京白梨’杂交后代高酸个体(GS-Y14)和低酸个体(DS-Y182)为试材,系统分析了果实发育过程中有机酸积累动态及相关酶活性的变化特征。结果表明:(1)GS-Y14属于苹果酸优势型果实,DS-Y182属于柠檬酸优势型果实,且成熟时两者在总酸含量上表现出的差异主要是由于苹果酸含量的差异所致。(2)苹果酸酶(NADP-ME)是苹果酸形成的关键酶,在梨果实发育过程中NADP-ME起分解作用,且该酶活性在两类个体果实发育后期差异显著,即NADP-ME是引起GS-Y14和DS-Y182中苹果酸含量不同的主要原因,进而导致成熟时两类个体果实酸积累的差异。(3)梨果实磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性的升高有利于其柠檬酸的合成,而柠檬酸合酶(CS)是影响其柠檬酸含量变化的关键酶;细胞质乌头酸酶(Cyt-ACO)和线粒体乌头酸酶(Mit-ACO)早期对果实柠檬酸的含量变化影响较小,后期异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)活性对柠檬酸在后代个体中的积累有一定影响。     

小麦叶片顺乌头酸酶对NO和H2 O2 的敏感性

外源一氧化氮（nitric oxide,NO)供体硝普钠（sodium nitroprusside,SNP)和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2)处理抑制小麦（Triticu aestivum L.)叶片顺乌头酸酶活性,抑制呈明显的浓度及时间效应;同时外源NO衍生代谢物过氧亚硝酸阴离子（peroxynitrite,ONOO^-)的供体3－morpholinosydnonimine hydrochlloride(SIN-1)和水杨酸（salicylic acid,SA)对酶活性也具有抑制作用,而且小麦叶片线粒体顺乌头酸酶对H2O2和SIN－1更敏感。分别以SNP与过氧化氢酶（catalase,CAT)专一性抑制剂氨基三唑（3－amino-1,2,4-triazole,3-AT)处理离体小麦叶片,发现在其内源H2O2含量上升的同时,顺乌头酸酶活性均呈浓度与时间依赖性下降趋势。表明NO除直接抑制顺乌头酸酶活性外,还可能经H2O2介导间接对顺乌头酸酶产生抑制作用。     

利用液体石蜡产生柠檬酸的菌种研究氟乙酸敏感株的获得及其与亲株的比较

以解脂假丝酵母菌8—2为出发菌株,采用亚硝基胍以及紫外线进行诱变,获得对于氟乙酸极为敏感,并利用柠檬酸能力甚弱的变异株NV-1。它在利用液体石蜡和单一正烷烃方面与亲株无明显差别;在摇瓶培养中产酸量相近,但产生柠檬酸的比例较亲株有明显的提高,约由50：50提高到80：20。考察其有关的酶活,乌头酸水台酶的活力有显著的差别,NV-1的酶活仅为亲株的一半左右。     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节 Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节——Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

植物呼吸及代谢的研究 Ⅴ.水稻幼苗亚细胞颗粒的氧化途径

本文报导了关于4天水稻黄化幼苗地上部的亚细胞颗粒氧化丙酮酸的途径的研究。下述结果证明在其中有三羧酸循环运行:1.琥珀酸、α-酮基戊二酸能迅速地被氧化,柠檬酸、苹果酸、延胡索酸以顺序降低的速率为此颗粒制剂氧化。2.丙酮酸的氧化能为催化量的琥珀酸所引发,说明有缩合酶的活性存在。3.琥珀酸的氧化能为丙二酸所抑制。α-酮基戊二酸的氧化能为亚砷酸钠所抑制,并且此被抑制的耗氧可借加入琥珀酸而得到恢复。4.氧化产物的纸上层析鉴定表明:琥珀酸能转化为延胡索酸、苹果酸和异柠檬酸;α-酮基戊二酸能转化为琥珀酸、延胡索酸和苹果酸。对亚细胞制剂及组织匀浆所作异柠檬酸酶及苹果酸合成酶的活性鉴定指出,在水稻幼苗氧化丙酮酸的途径中,乙醛酸循环可能与三羧酸循环同时存在。     

顺乌头酸酶为何不宜被划分为异构酶

用中间产物学说和化学反应的过渡态理论探讨了顺乌头酸酶为何不宜被划分为异构酶的原因.     

解脂假丝酵母(Candida lipolytica)B74利用正烷烃产生柠檬酸的研究

解脂假丝酵母(Candida lipolytica)B14以正烷烃为碳源可以形成柠檬酸和异柠檬酸。在正烷烃、(NH4)2SO4 过磷酸钙、玉米浆和NaCl等组成的培养基上,发酵4天,发酵液中柠檬酸含量达6．95％。用吡啶显色,总酸(以柠檬酸计)含量达13.78％。将异柠檬酸转化为柠檬酸,发酵液中柠檬酸含量上升到12—13％,柠檬酸占总酸的比例从40一50％提高到80—90％。原料转化率(产酸量与正烷烃量之比)按柠檬酸计达1I 2％,总醛转化率达132．5％,最高达184．1％。     

植物顺乌头酸酶及其生理功能

介绍了植物顺乌头酸酶酶学特性、分子生物学及其生理功能的研究进展,对其在一氧化氮(NO)介导的植物抗病信号转导和NO、SA以及H2O2对话中的可能作用也作了概述。     

甘蓝型油菜子油分的积累与某些生理变化关系的研究

油菜种子发育过程中,其内部的生理代谢过程发生了规律性的变化。伴随着种子的发育进程,６－磷酸葡萄糖脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性均有不同程度的增强。在油分旺盛合成期,６－磷酸葡萄糖脱氢酶和异柠檬酸裂解酶的活性均达到了最大值,而此时,异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活属于匀增加较慢;在种子的不同发育时期,高含油量品系的６－磷酸葡萄糖脱氢酶和异柠檬酸裂解酶的活性均高于低含油量的     

TCA循环中间产物对酿酒酵母胞内代谢关键酶活性的影响

对酿酒酵母在添加苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的混合培养基与其在YEPD培养基中胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活力差异进行了对比分析。结果表明:添加苹果酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.82%、57.23%、39.15%、12.10%;添加柠檬酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的酶活分别下降50.17%、42.20%、48.40%;添加琥珀酸使胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.16%、34.16%、50.87%、50.87%、12.37%。丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶对3种有机酸的耐受性较差,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶对3种有机酸的耐受具有选择性。     

发酵液中柠檬酸含量的分光光度法测定

目前,柠檬酸一般采用微生物发酵方法生产。以糖质为原料的柠檬酸发酵液中,除柠檬酸外,尚可能含有草酸、乌头酸、苹果酸和葡萄糖酸等。由于生产菌种和工艺技术的不同,各种酸的含量也不完全一样,用碱滴定测总酸的方法不能反映柠檬酸的真实含量。因此,多以五溴丙酮法进行测定。但是,以糖蜜作原料的柠檬酸发酵中,由于原料所含杂质的干扰,给测定造成很大困难。为寻找一个适于以糖蜜为原料的发酵液中柠檬酸含量的测定方法,我们采用紫外分光光度计法进行测定,结果表明:该法最大相对误差不超过3.7％。     

固定化胞外邻苯二酚1，2－双加氧酶的研究

首次将胞外邻苯二酚1,2－双加氧酶固定化,并用于制备顺,顺—己二烯二酸.该固定化酶表观活力高,使用范围扩大,耐酸性及耐碱性都有显著提高,并且使用稳定性好,得到的产物浓度及纯度均较高,酶与产物容易分离,整个工艺简单、独特、新颖,有利于工业化应用.     

萌发木豆种子中酸性磷酸酯酶的纯化和动力学特性

以对硝基苯磷酸为底物检测酶活性,通过20%～60%硫酸铵分部、DEAE-葡聚糖A25、羟基磷灰石、伴刀豆球蛋白-琼脂糖4B柱层析,从木豆萌发的种子中纯化到一个同工酶APaseⅡ,酶最终纯化倍数为247倍,比活力达51.8U/mg蛋白。非变性PAGE和SDS-PAGE表明所纯化的酶已经达到电泳纯,是一个分子量为33.1kDa的单体蛋白。APII的最适pH为5.0,最适温度为35℃,在pH3.5～7以及55℃以下稳定。该酶对焦磷酸有最大活性,受K+和Mg2+激活,受Fe2+,Mn2+,Mo7O246-,F-及酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、乙醛酸和抗坏血酸等有机酸抑制。     

PGDH^L生化突变型谷氨酸生产菌株选育的生化模式

以Ｔｂｍ－３（ｉｃｌ＾－,异柠檬酸裂解酶活力的生化突变株）为出发菌株,经紫外一诱变,通过依据生人代谢所设计的选择培养基（Ｌ－阿拉伯糖平板与Ｄ－葡萄糖酸钠平板）对接的筛选方法,获得磷酸葡萄糖酸脱氢酶（ＰＧＤＨ,Ｅ．Ｃ．４．２．１．１２）忖突变型的生化突变型菌株Ｔｂｍ３．１８,该菌株经摇瓶发酵试验显示,比出发菌株Ｔｂｍ－３提高产酸率８．９％和转化率８．１％,表明ｐｇｄｈ或ｐｇｄｈ生在变型菌株的选育,对     

定向选育衣康酸高产菌株的研究

以衣康酸生产菌土曲霉Ａ９００２为出发菌株,经紫外线及亚硝基胍复合诱变后再行定向选育,即在以衣康酸为唯一碳源的培养基中富集不能同化衣康酸的菌种,将将它们涂布在含乌头酸酶抑制剂（单氟醋酸）的高糖、高衣康酸平板培养基上,最后从中而筛选出一支衣康酸氧化酶弱,乌头酸酶活强,并耐自身代谢产物的高产突变株Ａ９００３。此菌株在摇瓶培养７２ｈ后,产酸为９．２％,转化率为５８．１％,在１００ｍ＾３发酵罐生产性试验中,     

代谢工程改造大肠杆菌提高乙醇酸产率

乙醇酸(Glycolate)是一种在工业上有多种用途的重要化合物。本研究首先在大肠杆菌MG1655(DE3)中敲除了ldh A(乳酸脱氢酶),获得菌株Mgly1,作为出发菌株。然后通过调节乙醇酸合成途径的关键酶——异柠檬酸裂解酶(ace A)、乙醛酸还原酶(ycd W)、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(ace K)的表达水平,得到乙醇酸产率为0.24 g/g葡萄糖(占理论产率的28.2%)。过量表达柠檬酸合成酶(glt A),乙醇酸产率提高到0.326 g/g葡萄糖(占理论产率的38.3%)。然后在Mgly1中敲除了glc B和ace B(苹果酸合成酶),减少了乙醇酸合成的前体乙醛酸的消耗。最终获得的工程菌株Mgly335乙醇酸产率达到0.522 g/g葡萄糖(占理论产率的61.4%)。     

江滩与兴林垦种区钉螺体内几种酶活性的比较

在自动化分析仪上分析了兴林垦种林区内钉螺和草和滩钉螺的总蛋白（ＴＰｒ）含量和谷丙转氨酶（ＧＰＴ）、谷草转氨酶（ＧＯＴ）以及碱性磷酸脂酶（ＡＬＰ）的活力和比活力,及其受林地地下水位高度的影响,结果表明,林地钉螺的ＧＯＴ、ＧＰＴ酶活力和比活力均比滩于钉螺显著提高,ＡＬＰ活力较稳定,但比活力增加,林地内随地下水位降低,钉螺体内总蛋白含量下降,ＧＯＴ、ＧＰＴ比活力均显著升高。