动物乳杆菌的分离鉴定及其抑菌蛋白的特性分析

通过滤纸片法从健康肉猪猪大肠、小肠中分离得到212株抗生物质产生菌, 以杯碟法复筛, 得到1株对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等革兰氏阴性菌以及部分真菌如禾谷镰刀霉(Fusarium graminearum)均有强烈抑制作用的乳酸菌。经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析等手段鉴定该菌株为动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)。排除酸和过氧化氢的干扰后, 该菌株的发酵上清液对指示菌仍有明显抑菌活性; 用蛋白酶处理该菌株的发酵上清液后, 抑菌活性丧失; 发酵液粗提物具有较好的热稳定性(经121°C处理20 min仍有较强抑菌活性)以及较宽的抑菌活性pH值范围(3.5~5.5), 因此初步认为该菌株产生一类具有广谱抑菌活性的类细菌素物质。     

瑞士乳杆菌M14-1所产细菌素的分离纯化及抑菌特性分析

瑞士乳杆菌M14-1发酵上清液经硫酸盐沉淀后得到粗蛋白提取物,再经离子交换、C18固相萃取进行进一步纯化后得到高纯度的纯化产物。研究细菌素M14-1酶敏感性、酸碱稳定性、热稳定性、抑菌谱以及细菌素产量与菌株生长关系。研究发现细菌素M14-1对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感,对过氧化氢酶不敏感。该细菌素热稳定性较差,121℃处理15 min后,活性下降。细菌素M14-1在pH2.0~10.0内具有抑菌活性。抑菌谱结果表明细菌素M14-1抑菌谱较窄,仅对单增李斯特氏菌有较好的抑制效果。瑞士乳杆菌M14-1在发酵16h后达到稳定期,而细菌素M14-1最佳收获时间为瑞士乳杆菌M14-1发酵12 h后。     

1株植物乳杆菌的抑菌作用及其生物学特性的研究

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸杆菌中的一种,常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体肠道的益生菌群,具有维持肠道菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种作用。研究从市售腌渍蔬菜中分离筛选获得一株植物乳杆菌,以9种菌作为指示菌,采用牛津杯琼脂扩散法检测筛选菌株的抑菌谱大小。结果表明,该菌株能较强的抑制大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等指示菌。此外,研究了菌株对温度的稳定性,p H值的耐受性及其酶的敏感性等生物学特性,结果显示该株植物乳杆菌菌株具有良好的热稳定性,酸碱稳定性,并且对3种蛋白酶具有很好的敏感性。这为今后深入研究与开发植物乳杆菌奠定了基础。     

Viili乳制品中干酪乳杆菌的分离鉴定

从引进Viili乳制品中筛选、鉴定出3种优良乳酸菌。采用平板分离法从Viili乳制品中分离3株乳酸菌,通过表型1、6S rRNA的PCR扩增、克隆、测序鉴定。3株乳酸菌的表型鉴定结果符合伯杰细菌鉴定手册中乳杆菌属的干酪乳杆菌,16S rRNA序列同源性分析结果表明3株分离菌与干酪乳杆菌的同源性分别为99.93%、100.00%9、9.78%,从Viili乳制品分离到3株干酪乳杆菌。     

长寿老人源产细菌素乳酸菌的筛选与分子生物学鉴定

本研究以124株我国广西巴马百岁以上长寿老人源乳酸菌菌株为试材,采用双层琼脂平板扩散法筛选产细菌素的优良菌株。在排除有机酸、H2O2等的干扰后,菌株B02、B03、B04、B07、B11、B25、B24和B78的发酵上清液对受试的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等5株指示菌都表现出很强的抑制作用;进一步硫酸铵沉淀、透析及浓缩处理后,其抑菌活性显著增强,同时蛋白酶敏感性试验显示其具有蛋白质性质,这些结果共同确定其为乳酸菌细菌素。最后,通过16S rRNA序列分析鉴定后确定B02为副干酪乳杆菌;B03为植物乳杆菌;B04为动物双歧杆菌;B07为干酪乳杆菌;B11为德氏乳杆菌保加利亚亚种;B24为鼠李糖乳杆菌;B25为粪肠球菌;B78为植物乳杆菌。     

豆豉中高效抑菌活性乳酸菌的筛选及其抑菌研究

目的从云南传统发酵豆豉中分离乳酸菌,并从中筛选具有高抑菌活性的菌株,进一步研究其抑菌谱,并初步分析其抑菌机制,为新型生物防腐剂的开发提供理论依据。方法应用传统纯培养技术及spot-on-lawn法从云南传统发酵豆豉中筛选得到具有抑菌作用的乳酸菌40株,并从中筛选得到1株具有高效抑菌活性的植物乳杆菌YM-4-3菌株。通过HPLC和紫外分光对其主要抑菌物质进行分析与抑菌试验。结果 YM-4-3菌株是1株具有新型生物防腐剂应用潜力的乳酸菌菌株。结论初步推测YM-4-3菌株抑菌机制为有机酸主导,细菌素和其他化学抑菌物质协同作用。     

具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和活性产物

【目的】植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,为了筛选到能在植物体内稳定定殖并且对植物寄生线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌生防菌。【方法】以松材线虫为靶标,用直接触杀法进行筛选。对高活性菌株采用正交实验优化发酵条件,测定发酵液杀线虫活性的稳定性,并对菌株进行鉴定。【结果】从6种植物中分离筛选出13株对松材线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌菌株,这些菌株的发酵上清液对松材线虫处理24h杀线虫率均达到了100%;其中BCM2、SZ5、CCM7和DP1这4个菌株的杀线虫活性较高,发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率均达到95%以上,DP1和SZ5菌株达到了100%;并发现部分菌株发酵液能使线虫虫体发生渗漏或消解。发酵条件优化后能使发酵液杀线虫效果提高4倍。4株高活性菌株产生的杀线虫物质均对蛋白酶稳定、耐热不耐酸碱且长时间保藏活性不下降。经过鉴定DP1和CCM7是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),BCM2和SZ5是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】经济作物体内存在一定数量的能产生杀线虫活性物质的内生细菌,其中一些细菌产生的杀线虫物质具有较强的稳定性。认为杀线虫活性的植物内生细菌具有很大的生防潜力。     

生殖道中具有抑菌活性乳酸菌的分离筛选及其抑菌物质分析

目的 从阴道炎患者的棉拭子样本中分离筛选具有抗菌活性乳酸菌,为研究对细菌性阴道炎具有确实疗效的微生态制剂提供理论与菌种保证.方法 应用纯培养技术及双层平板法从阴道样品中分离筛选具有较好抑菌活性的乳酸菌.通过有机酸排除试验、过氧化氢排除试验和蛋白类抑菌物质排除试验对具有较好抑菌活性菌株的主要抑菌物质分析,并通过PCR反应对是否具有细菌素相关基因进行鉴定.结果 从7个棉拭子样本中共分离得到26株乳酸菌,其中有6株呈现抑菌活性.K4M2、K4M5、K4M6和K4M8菌株的主要抗菌物质为有机酸.而K4M9、K4M10两株植物乳杆菌的主要抗菌物质除有机酸外,尚可以产生细菌素.病原菌拮抗试验结果表明,这两株菌株的混合培养上清对具有较好的抑菌效果.结论 K4M9、K4M10菌株有望作为微生态制剂用于细菌性阴道炎的临床防治.     

两种高效抑菌乳酸菌素BSN4和BCN4的特性研究

对筛选到具有高效抑菌效果的植物乳杆菌SN4和粪肠球菌CN4产生的乳酸菌素进行进一步生物学特性研究。采用牛津杯法测定细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果,发酵上清制取乳酸菌素初提液,通过对两株乳酸菌产生的乳酸菌素进行蛋白酶、热和酸碱处理,研究其抑菌效果的稳定性,以及菌株的生长合成曲线和抑菌谱。试验结果表明:两种乳酸菌素对大部分蛋白酶较敏感,胰蛋白酶处理后乳酸菌素BSN4和BCN4分别能保留84%和55%活性;两种乳酸菌素在p H 4~10之间保持80%的抑菌活性(抑菌圈20 mm),在25~100℃处理20 min后能分别保留89.1%和74.4%以上的活性,乳酸菌素BSN4经120℃处理5 min后仍保留69%活性;菌株SN4在发酵10 h就能达到稳定期,并表现出较好地产酸性和抑菌活性。抑菌谱显示乳酸菌素BSN4和BCN4对革兰阴性菌和真菌无明显抑菌效果,但对大部分革兰阳性菌有较好的抑菌活性。结果显示,两种乳酸菌素对大部分革兰阳性菌有较好的抑菌效果,具有较好的环境耐受性,可为乳酸菌素在生产生活中的应用提供参考。     

唾液乳杆菌ZDY159a抑菌机制的研究

目的对唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ZDY159a的产酸能力和体外抑菌影响因素进行初步研究。方法采用共培养法和牛津杯法,以大肠埃希菌(Escherichia coli O157:H7)NCTC 12900和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC 26003作为指示菌。结果唾液乳杆菌ZDY159a发酵产生的乳酸和乙酸均具有较强抑菌活性;发酵全液的抑菌活性强于发酵上清液;低p H与发酵上清液的抑菌活性呈正相关;蛋白酶和过氧化氢酶处理可降低发酵上清液的抑菌活性。结论唾液乳杆菌ZDY159a的抑菌活性与发酵过程中产生的有机酸、细菌素(蛋白或多肽类物质)和过氧化氢有关,且菌体可提高发酵上清液的抑菌活性。     

一株盐湖芽孢杆菌LG的鉴定及其抗金黄色葡萄球菌活性研究

【目的】从运城盐湖中分离获得一株耐盐细菌LG,对其进行分类鉴定及抗菌特性研究。【方法】利用16S rRNA基因序列分析对菌株进行分类鉴定。以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用杯碟法对菌株LG发酵上清液进行抗菌活性检测,利用扫描电镜和透射电镜观察其抗菌效果。研究不同因素对上清液抗菌活性的影响,并采用PCR技术对菌株基因组进行功能基因筛查。【结果】系统发育分析表明该菌为Bacillus属成员,在0–25%的NaCl浓度范围内生长良好,为耐盐细菌。电镜观察发现,菌株LG发酵上清液处理金黄色葡萄球菌可导致细胞结构明显出现异常,细胞质泄漏。抗菌稳定性研究表明,菌株LG发酵上清液活性稳定,表现出了良好的对紫外光、温度、pH和NaCl的耐受性。采用特异性引物,通过PCR筛查发现菌株LG基因组中含有聚酮合酶(PKS I)基因和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因,表明该菌具有产多种代谢产物的潜力。【结论】极端环境中的微生物资源可作为抗菌活性物质的潜在新来源。     

拮抗枯草芽孢杆菌KC-5的分离鉴定及其发酵优化

为了筛选出对植物病原菌具有拮抗作用的生物防治细菌,采用平板对峙法从蔬菜根际土壤中分离获得一株对多种病原真菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌,并对抑制后的病原菌菌丝进行了观察,结果表明该菌株对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、层出镰刀菌以及腐皮镰刀菌均具有抑菌活性。通过形态特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵培养基进行了优化。     

牛源多杀性巴氏杆菌的分离与初步鉴定

【目的】本研究旨在对引起犊牛呼吸道综合征的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,分析其亲缘关系和毒力基因的分布情况。【方法】收集2017年8月至2018年4月疑似患有犊牛呼吸道综合征的病牛鼻拭子进行细菌分离培养,对菌落形态和染色疑似巴氏杆菌的菌株进行16S rRNA测序和血清型鉴定,选择巴氏杆菌7类23种毒力基因,筛查临床分离株的毒力基因的分布。【结果】从8个省份的237份病料中分离出31株多杀性巴氏杆菌,分离率为13.1%。16S rRNA测序分析表明31株A型多杀性巴氏杆菌属于同一亚群,其序列同源性与中国分离株HB01以及国外分离株USDA-ARS-USMARC-60712、USDA-ARS-USMARC-60214、ATCC 43137以及36950亲缘关系较近。对分离出的31株A型多杀性巴氏杆菌的7类共23种毒力基因鉴定,结果显示31株多杀性巴氏杆菌所携带的毒力因子大多分布在17–19个,且集中度较高。【结论】A型多杀性巴氏杆菌为犊牛呼吸道综合症的主要流行血清型,通过对多杀性巴氏杆菌的临床分离株进化树和毒力基因分析,内蒙古、黑龙江、新疆、山西以及河北的7株分离株进化来源于同一分支,且均缺失毒力基因tadD和hgbA及携带毒力基因hsf-1,提示着其亲缘关系可能与其携带的特定毒力基因存在一定相关性。该研究为犊牛呼吸道综合征的病原学调查和多杀性巴氏杆菌流行病学调查提供了参考数据。     

植物乳杆菌DY6主要抑菌代谢物的分析和鉴定

【背景】被广泛应用于食品和饲料等多个行业的乳酸菌已成为制作生物防腐剂的研究热点。【目的】探究抑菌性能良好的植物乳杆菌DY6的抑菌物质,为其进一步应用提供参考依据。【方法】对植物乳杆菌发酵液中抑菌物质的理化特性进行研究,采用GC-MS分析发酵上清液代谢物,通过多元统计学分析方法推测主要抑菌物质,抑菌物质通过半制备进行初步分离后用GC-MS鉴定。【结果】植物乳杆菌DY6对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌都有较强的抑制作用。采用不同发酵时间的发酵液作为研究对象,测定发酵上清液的抑菌能力,发酵0-4 h上清液无抑菌能力,发酵至8 h抑菌能力逐步上升,发酵24-48 h发酵上清液抑菌能力趋于稳定,在48 h时抑菌能力最佳,抑菌直径为15.28mm。通过多元统计学分析乳酸菌发酵液差异标志物,发现主要差异物为有机酸(如乳酸、乙酸、丙酸等)和脂肪酸(如辛酸、癸酸等)。经过半制备液相分离发酵上清液得到的抑菌组分,主要有有机酸(如乳酸、乙酸、3-苯基乳酸、苯丙酸等)和脂肪酸(如癸酸、辛酸、壬酸等),另外还有少量的醛类和醇类物质。【结论】确定了植物乳杆菌DY6的抑菌物质主要为有机酸和脂肪酸,为其进一步防腐应用提供了理论基础。     

具有拮抗无乳链球菌能力乳杆菌的筛选及抑菌特性

目的从罗非鱼(Nile tilapia)肠道中筛选出具有抑菌作用的乳杆菌,测定其对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的抑菌效果,分析乳杆菌抑制无乳链球菌的有效成分,并利用分子生物学手段对筛选的乳杆菌菌种进行鉴定。方法采用双层平板法对具有抑制无乳链球菌的乳杆菌进行筛选,牛津杯法对抑菌效果进行测定,酶蛋白敏感性测定、热处理、有机酸处理等方法分析抑菌活性物质有效成分,16S rDNA分子标记对乳杆菌进行鉴定。结果从罗非鱼肠道中筛选出14株乳杆菌,其中菌株RS2对无乳链球菌具有明显的抑菌效果;不同蛋白酶种类、pH处理对乳杆菌无细胞培养液均有不同的影响,经80℃处理的乳杆菌无细胞培养液,其抑菌效果未显著改变(t=0.169 2,P=0.873 8)。此外,此株乳杆菌对猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺菌(Shigella sp.)等病原菌具有良好的抑制作用。经鉴定,该乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。结论从罗非鱼肠道中分离得到的植物乳杆菌菌株RS2对无乳链球菌等致病菌具有一定的抑制作用,推断其抑菌有效成分为细菌素类物质。此项研究对开发抗生素替代产品,提高食品的品质具有一定价值。     

云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究

为从湖泊沉积物中筛选出对动物病原菌具有抑菌活性的芽孢杆菌Bacillus,采用纯培养方法对云贵川地区9个湖泊样品中的芽孢杆菌进行分离、16S rRNA基因序列测定和发酵,以4株常见动物病原菌作为对象,对芽孢杆菌次级代谢产物进行活性检测,筛选有抗菌活性的菌株,并对活性菌株的发酵产物进行液相色谱-质谱联用技术分析。结果显示,在9个湖泊样品中共分离出47株芽孢杆菌,筛选出13株有抗菌活性的菌株,且其产生的脂肽类抗生素对动物病原菌显示出较好的抗菌活性。本研究不仅扩大了芽孢杆菌物种资源信息库,为后续开展芽孢杆菌次生代谢产物研究奠定理论依据。同时也为开发新型动物致病菌抗生素提供了新的途径。     

猪源乳酸菌的分离、鉴定及其生物学特性

【目的】将分离自猪肠道粘膜、食糜和粪便的乳酸菌,通过产乳酸能力、生长性能、耐酸和耐胆盐性能及抑菌能力评价,筛选适应养猪生产的潜在益生特性的菌株。【方法】共分离获得155株乳酸菌纯菌株,从中筛选出4株产酸能力较强的乳酸菌,结合生理生化试验及细菌16S rRNA测序鉴定其种属,评价候选乳酸菌的生长情况、耐酸、耐胆盐及抑菌特性。【结果】综合变色时间(8 h)、pH值(3.9)和乳酸含量(100 mmol/L),筛选出4株(L45、L47、L63和L79)候选菌株,经鉴定依次为罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、约氏乳杆菌和粪肠球菌。该4株乳酸菌均可在体外快速生长;L47和L79能够耐受pH 2.5的酸性环境,L47能够耐受0.5%胆盐环境;各乳酸菌上清液与指示菌共培养,发现对E coli K88和沙门氏菌均产生了抑制作用,其中L47上清液对指示菌的抑制作用较强。【结论】L47具有较好的产酸性能与生长性能、可耐受猪胃酸和肠道胆盐环境,对E.coli K88和沙门氏菌具有较好的抑制作用,说明该乳酸菌具有潜在的益生特性。     

植物乳杆菌CMCC-P0002代谢产物中抑菌物质的研究

目的通过对一株植物乳杆菌代谢产物的抑菌作用以及该产物的某些物理特性的研究,为进一步发现可替代现有抗生素的抗菌物质奠定基础。方法首先利用低温离心和超滤法对植物乳杆菌培养后的上清液进行初步提取,用打孔法行抑菌试验,明确其对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌等临床分离菌株的抑菌活性;并进一步经加热、调整pH及过氧化氢酶等处理上清液后,再验证其活性变化。结果植物乳杆菌的培养上清液对铜绿假单胞菌等多株临床分离菌株均具有一定的抑菌活性,且以pH在6以内时该物质抑菌活性较好,过氧化氢酶处理后或加热至100℃、30min,上清液的抑菌活性依然存在。结论在植物乳杆菌的培养上清液中存在着具有抑菌活性的物质,对从临床标本所分离的部分革兰阴性菌及革兰阳性菌有抑菌作用,该物质对热耐受,其活性受pH变化的影响。     

产淀粉酶益生乳杆菌的筛选及鉴定

目的以健康仔猪肠道及粪便样品为基础,从中筛选产淀粉酶的乳杆菌菌株,并评价其作为益生菌候选菌株潜力。方法用MRS培养基分别从仔猪新鲜粪便和小肠黏膜上分离到乳酸菌,采用改良的产淀粉酶选择性培养基初筛得到能降解淀粉活性的菌株,并研究菌株的淀粉水解活性、抗逆能力、粘附特性及对抗生素的敏感性。结果从备选的485株乳酸菌中筛选得到具有初步淀粉酶活性的菌株25株（占总筛选数量的5.2%）,复筛选育得到具有较强淀粉酶活性的乳杆菌3株。进一步研究了这3株乳杆菌的抗逆能力、粘附特性以及对抗生素的耐药性,并对最终选育得到的菌株进行生理生化及16S rRNA分子鉴定。经选育鉴定的罗伊乳杆菌G8-5淀粉降解能力最强,并能耐受pH 3.0的酸度、1.0%的胆盐浓度,在小肠上皮细胞上的粘附效率超过15个以上,并对常用的抗生素具有较高的敏感率。结论罗伊乳杆菌G8-5符合安全益生菌的要求,可以作为产淀粉酶的益生乳杆菌优良的候选菌株。     

一株产淀粉酶芽胞杆菌SY200的鉴定及其对动物病原菌的生物拮抗试验

目的对一株产淀粉酶芽胞杆菌SY200进行鉴定及其对动物病原菌的生物拮抗试验。方法提取芽胞杆菌SY200基因组DNA,采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增及对扩增到的目标片段的测序,将测序结果与NCBI上已知菌种的16S rRNA序列进行BLAST对比,并构建系统进化树进行分析。采用滤纸片法和牛津杯法分别研究该芽胞杆菌的全菌液及培养物上清液对3株病原菌的生物拮抗。结果结合细菌形态观察及生理生化特性鉴定,最终确定菌株SY200为甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus);芽胞杆菌SY200全菌培养液和培养上清液对产肠毒素大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、金黄色葡萄球菌均有较强的生物拮抗作用,抑菌物质主要为细菌的代谢产物。结论芽胞杆菌SY200被鉴定为甲基营养型芽胞杆菌,该菌株对3株动物性病原菌具有较强的生物拮抗作用。