转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。     

异源表达CkLEA1基因增强了拟南芥对非生物胁迫的耐受性

植物在生长过程中会受到各种非生物胁迫的伤害,导致生长发育和产量受到严重影响,胚胎晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins,LEA蛋白）在植物抵抗非生物胁迫过程中起着重要的保护作用。在前期的研究基础上,将受多种胁迫诱导的柠条锦鸡儿CkLEA1（GenBank登录号KC309408）基因转入野生型拟南芥,通过实时荧光定量PCR从7株T₃代纯合体中筛选出3个转基因株系做进一步研究。种子萌发率实验发现,在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇处理下,转基因株系萌发率均高于野生型拟南芥。干旱处理2周大的幼苗后,转基因株系明显比野生型更抗旱,存活率高于野生型,并且失水率低于野生型。同时,转基因株系积累了较少的丙二醛（MDA）,超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量也高于野生型。这些结果表明,柠条锦鸡儿CkLEA1基因在种子萌发阶段提高了拟南芥对盐和渗透胁迫的耐受性,并且提高了转基因拟南芥幼苗生长阶段对干旱胁迫的抵抗能力。     

转ZjAPX基因拟南芥对NaCl、干旱胁迫的耐性研究

旨在探讨枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX在植物渗透胁迫中的作用。将ZjAPX基因转入到模式植物拟南芥,以野生型(WT)、转ZjAPX拟南芥株系T2为试材,进行不同浓度NaCl胁迫和干旱胁迫。结果表明,转基因株系的种子萌发、植株生长均优于野生型株系;荧光定量PCR检测转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫处理10 d后目的基因ZjAPX的表达量显著高于野生拟南芥,表明ZjAPX的高表达明显提高了植株的抗旱和耐盐性。     

中间锦鸡儿CiPUB22基因克隆与功能分析

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)耐旱、耐寒、耐盐碱,是西北干旱地区的重要固沙灌木,筛选其优良抗逆境基因,可以作为林草基因工程的基因源。该研究在中间锦鸡儿干旱胁迫转录组文库中找到1条CiPUB22 (plant U box 22)基因的cDNA全长序列,CiPUB22基因包括1 260 bp开放阅读框,编码419个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明,在脱水、盐和ABA处理1 h后CiPUB22基因表达量上升并达到最高水平,分别为对照表达量的12倍、35倍和7倍,干旱处理后12 d达到最高值,为对照的2.5倍,表明CiPUB22的转录水平受非生物胁迫诱导。构建CiPUB22基因的过表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因纯合体株系抗逆性分析发现,在150 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA和400 mmol/L甘露醇处理下,过表达株系的萌发率均低于野生型,说明过表达CiPUB22基因降低了拟南芥在种子萌发过程中对盐和渗透胁迫的耐受性。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

沉默VHA-c4基因对拟南芥根长和种子萌发的影响

为了研究植物液泡H+-ATPase c亚基VHA-c4基因在拟南芥响应非生物胁迫中的作用,本研究构建了拟南芥VHA-c4基因沉默载体,利用农杆菌介导,将线性化的沉默载体dsDNA片段整合在拟南芥基因组上,筛选获得了能够不同程度特异沉默VHA-c4基因的7个转基因株系c4-1～c4-7,并对VHA-c4基因沉默效果最好的株系c4-2进行NaCl、ABA、6%葡萄糖胁迫处理。结果显示:在特定浓度梯度的NaCl处理后,沉默株系c4-2的主根相对伸长量和种子萌发率都被明显抑制,并且被抑制效果远远高于野生型株系。然而,在特定浓度梯度的ABA和葡糖糖处理后,沉默株系c4-2的主根相对伸长量和种子的萌发率虽然也都有一定程度的抑制,但是其被抑制效果远远低于野生型拟南芥。结果显示沉默了VHA-c4基因后,显著降低了拟南芥对NaCl的耐受性,影响了其的生长发育,然而对ABA和葡糖糖的抑制作用却表现为很不敏感,这可能是因为H~+-ATPase在盐胁迫信号通路和ABA信号通路中起着不同的(正负)调控功能。     

VHA-c2&c4双基因沉默株系拟南芥对NaCl与ABA的响应

研究液泡H~+-ATPase c亚基基因(VHA-c2和VHA-c4)在植物生长发育及响应非生物胁迫过程中的功能,构建拟南芥VHA-c2c4的RNAi表达载体,通过浸花法转化野生型拟南芥。利用卡那霉素筛选纯合体株系,进行半定量PCR鉴定,并对其进行NaCl和ABA胁迫处理。获得7个T_2代双沉默基因纯合体株系,其VHA-c2和VHA-c4的mRNA表达水平均低于野生型。挑选沉默效率较高的3个株系进行NaCl和ABA处理,在NaCl处理下,它们的主根相对伸长量和种子萌发率均小于对照,表明VHAc2c4沉默株系对NaCl胁迫作用敏感。ABA处理下,子叶的展开程度和主根相对伸长量均比对照高,表明VHA-c2c4沉默株系对ABA抑制作用不敏感。NMT试验表明ABA促进了双沉默基因纯合体株系的H+内流能力。推测VHA-c2和VHA-c4的转录水平影响了植物对盐胁迫和ABA介导的信号转导途径的响应。     

J-蛋白AtJ8在拟南芥渗透胁迫适应方面的作用

At J8是拟南芥J-蛋白家族成员。已有报道,At J8定位于叶绿体中,参与光合作用的调节。该文主要研究At J8在适应盐和水分胁迫方面的作用。实时定量PCR结果表明,盐、水分胁迫及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导At J8基因的表达。反向遗传学研究显示,在正常生长条件下,At J8突变体(atj8-1)的种子萌发率及绿色子叶出现率与野生型(WT)和突变体恢复株系(R4-1)没有明显差别;在盐和水分胁迫条件下,atj8-1种子萌发延迟,绿色子叶出现率明显低于WT和R4-1株系,表明At J8可能在调节种子及幼苗对渗透胁迫的适应性方面发挥重要作用。此外,实时定量PCR结果显示,At J8基因突变改变了ABA反应基因ABI1、ABI2、RAB18、RD29A和RD29B的表达,说明At J8调节植物对渗透胁迫的适应性可能是通过影响ABA信号途径来完成的。     

转CiCHS基因拟南芥的黄酮代谢及抗氧化能力分析

该研究克隆了中间锦鸡儿的查尔酮合成酶基因(CiCHS)并转入野生型拟南芥和tt4突变体,用qRT-PCR检测了转基因拟南芥中内源AtCHS基因的表达量,用分光光度法分析了转基因拟南芥的总黄酮、丙二醛含量及DPPH自由基清除能力,用HPLC法检测了转基因拟南芥的柚皮苷含量。结果显示:(1)转基因拟南芥中,内源AtCHS基因的表达量约为野生型的十分之一,总黄酮含量明显高于野生型;HPLC测得转基因株系中柚皮苷含量高于野生型;紫外照射处理前后转基因拟南芥中丙二醛积累量明显少于野生型。(2)转基因株系提取物对DPPH自由基清除能力显著高于野生型。(3)CiCHS基因互补拟南芥tt4突变体,转基因株系的种皮呈现浅棕色。研究表明,中间锦鸡儿CiCHS基因异源表达后生成了柚皮苷,使转基因植物的抗氧化性增强,部分恢复了tt4突变体的种皮颜色。     

互花米草NHX2基因的克隆与功能鉴定

NHX2属于CPA1基因家族,编码Na~+/H~+逆向转运蛋白,控制液泡膜中活性K~+的摄取,同时调节气孔的关闭。该研究以耐盐植物互花米草为材料,采用PCR技术克隆NHX2基因,并将其转入拟南芥进行相关功能鉴定。结果显示:(1)成功克隆获得互花米草NHX2基因CDS序列(1 602 bp),命名为SaNHX2,该基因编码533个氨基酸,SaNHX2蛋白的分子量约为58.65 kD,定位于细胞核和细胞膜,表明SaNHX2基因可能发挥转录调控的功能。(2) qRT-PCR结果显示,在ABA、NaCl和干旱胁迫处理下,互花米草叶和根中SaNHX2基因的表达量均上调。(3)为进一步鉴定其功能,成功构建植物表达载体,将SaNHX2基因转入拟南芥;经RT-PCR检测结果显示,SaNHX2基因在转基因植株中过表达;高盐胁迫处理后,转SaNHX2基因拟南芥的主根长度、叶绿素总量和相关胁迫应答基因表达量均高于转空载拟南芥,表明转SaNHX2基因拟南芥的耐盐能力显著增强。研究表明,SaNHX2基因可能在盐胁迫调节机制中发挥调控作用,可作为改良农作物耐盐的重要候选基因。     

盐胁迫对二穗短柄草幼苗生长及不同器官中盐离子稳态的影响

采用4种浓度的NaCl溶液(50、100、150、200 mmol/L)处理二穗短柄草和拟南芥(对照)幼苗,测定不同浓度盐胁迫下2种植物幼苗的生长指标和离子分布,以探讨二穗短柄草在盐胁迫下主要阳离子平衡机制.结果表明:(1)盐胁迫显著抑制二穗短柄草根叶的生物量积累.(2)根冠比数据显示,在盐胁迫条件下二穗短柄草能够更好地维系地下部分的生物量积累.(3)在4种浓度盐胁迫下,二穗短柄草叶中Na+含量低于根系,而且K+、Cl-含量和K+/Na+比值始终高于根系,说明在二穗短柄草中Na+从地下到地上的转运受到抑制,但对Cl-的转运缺乏有效的调控.(4)回归分析发现,盐胁迫下二穗短柄草和拟南芥根部Na+与K+含量变化呈正相关关系,而在叶部则不相关,说明二穗短柄草和拟南芥Na+与K+在根部具有相同的离子通道,而在叶部却具有各自独立的转运途径.     

Overexpression of wheat dehydrin DHN-5 enhances tolerance to salt and osmotic stress in <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis thaliana</Emphasis>

Late Embryogenesis Abundant (LEA) proteins are associated with tolerance to water-related stress. A wheat (Triticum durum) group 2 LEA proteins, known also as dehydrin (DHN-5), has been previously shown to be induced by salt and abscisic acid (ABA). In this report, we analyze the effect of ectopic expression of Dhn-5 cDNA in Arabidopsis thaliana plants and their response to salt and osmotic stress. When compared to wild type plants, the Dhn-5 transgenic plants exhibited stronger growth under high concentrations of NaCl or under water deprivation, and showed a faster recovery from mannitol treatment. Leaf area and seed germination rate decreased much more in wild type than in transgenic plants subjected to salt stress. Moreover, the water potential was more negative in transgenic than in wild type plants. In addition, the transgenic plants have higher proline contents and lower water loss rate under water stress. Also, Na⁺ and K⁺ accumulate to higher contents in the leaves of the transgenic plants. Our data strongly support the hypothesis that Dhn-5, by its protective role, contributes to an improved tolerance to salt and drought stress through osmotic adjustment.     

Abscisic acid-insensitive mutations provide evidence for stage-specific signal pathways regulating expression of an Arabidopsis late embryo genesis-abundant (lea) gene

An Arabidopsis homolog of the abscisic acid (ABA)-inducible cotton D19 and wheat Em genes was cloned and its expression assayed at two developmental stages in wild-type, ABA-deficient (aba) and three ABA-insensitive (abi) lines of Arabidopsis thaliana. Expression of this gene was reduced slightly in seeds of aba mutants and approximately ten-fold in abi3 mutants, but seed expression was not decreased in either abi1 or abi2 monogenic mutants. In contrast, the abi1 and abi2 mutants showed a very slight reduction of ABA inducibility in 8-day-old plants, while the responses of aba and abi3 mutants were comparable to that of wild type. Although previous studies have shown that none of the abi mutations show completely stage-specific effects, the results reported here indicate that the importance of each of the ABI loci in regulating this single gene is stage-dependent. Furthermore, the fact that none of the abi mutations show more than minor effects on exogenous ABA inducibility of the Arabidopsis D19/Em homolog in young plants suggests that an additional ABA signalling pathway may be operating during vegetative growth.     

拟南芥类受体蛋白激酶基因CRK45对外源钙离子的响应

以拟南芥野生型和类受体蛋白激酶基因CRK45的T-DNA插入突变体crk45为材料,采用差异基因表达筛选技术检测ABA处理后野生型和crk45中基因表达的差异。结果显示:(1)crk45突变体中有1个基因的表达比野生型高约4倍。(2)NCBI数据库检索表明,该基因编码的蛋白具有EF手型结构,蛋白序列全长为130个氨基酸,是典型的Ca2+结合蛋白,故命名为CRK45抑制的钙离子结合蛋白(CICBP)。(3)Northern blotting分析结果显示,ABA处理后crk45突变体中CICBP的表达明显升高,证明CICBP基因的确受ABA诱导,且其表达受CRK45的抑制。(4)外源75mmol/L的Ca2+处理后,crk45突变体的萌发率(30.8%)显著高于野生型(17.16%),说明在Ca2+介导下CRK45的功能是抑制种子萌发。(5)qRT-PCR检测显示,野生型中CRK45的表达受Ca2+诱导明显升高,而crk45突变体中的表达一直保持很低,说明crk45突变体是一个基因敲除突变体;Ca2+处理后crk45突变体中CICBP基因表达上调,而野生型中CICBP的表达反而降低,说明Ca2+处理下CRK45抑制CICBP基因的表达。研究表明,ABA或Ca2+处理后,CRK45通过负调控CICBP基因的表达,从而抑制拟南芥种子萌发。     

马尾松HDR基因克隆及其对旱与盐胁迫的响应

干旱和土地盐渍化是制约林业可持续发展的重要因素,植物在遭受生物或非生物胁迫时,会在叶片释放萜类等挥发性物质。1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP途径的末端活性酶,具有提供前体萜类物质和主要限速作用。为探究马尾松HDR基因是否参与干旱和盐胁迫条件下的胁迫响应,该研究克隆了马尾松HDR基因开放阅读框,并初步分析了其生物信息、组织特异性表达水平和初步功能。结果表明:(1)PmHDR基因编码区长度为1 458 bp,编码485个氨基酸,其编码蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821多功能结构域,属于HDR家族。(2)PmHDR密码子使用偏好性较弱,偏好使用A/U结尾的密码子,烟草、拟南芥与酿酒酵母更适合作为其异源表达受体。(3)qRT-PCR结果显示,PmHDR基因在马尾松老叶中表达量最高,其次为幼叶、幼茎和老茎,在根中表达量最低。(4)构建基因表达载体pBI121-PmHDR并转化拟南芥,转基因拟南芥对干旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性。以上研究结果表明PmHDR参与了植物干旱和盐胁迫的响应和调节,并为马尾松抗逆育种提供了一定的理论支持。     

海岛棉GbHCT13基因的功能验证

该研究利用海岛棉‘新海21’和陆地棉ND203以及模式植物拟南芥,通过转基因及荧光定量检测等方法探究海岛棉GbHCT13基因(GenBank 登录号MW048849)在纤维发育中的功能。结果显示：(1)成功构建重组载体pCAMBIA3301 GbHCT13,经农杆菌介导法转化、除草剂抗性基因筛选、荧光定量检测方法鉴定获得转GbHCT13基因拟南芥T₃代植株4株;qRT PCR检测表明,转基因植株中GbHCT13基因表达量较野生型极显著增加。(2)转基因拟南芥过表达GbHCT13基因使植株同一时期的生长较野生型旺盛,株形、叶片数、抽薹数和茎秆表皮毛数量均与野生型存在差异;组织化学分析发现,转GbHCT13基因的拟南芥较野生型茎秆初生木质部生长活跃,导管增粗,次生木质部导管细胞壁横截面积变大,但髓质细胞无明显变化;过表达GbHCT13使拟南芥中木质素合成途径基因发生不同程度改变,其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL与GbHCT13基因的表达呈正相关。(3)经大田筛选、分子鉴定,成功获得转GbHCT13基因棉花植株3株;转GbHCT13基因棉花的棉纤维伸长率增加,纤维强度增大;沉默GbHCT13基因使棉花植株木质素含量降低,茎秆表皮毛数量减少,木质部导管细胞数量减少,导管细胞壁中木质素沉积量降低,而棉株并未发生株高上的明显矮化现象,且木质素合成通路中的CAD、CCoAOMT、CCR、PAL 4个基因的表达均呈降低趋势,说明抑制GbHCT13使得棉花生长代谢受阻,影响纤维发育起始。研究表明,GbHCT13基因能影响棉花植株中木质素合成从而调控纤维的生长发育,其功能与GbHCT13基因在模式植物拟南芥中的基本一致。