小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体过程中的细胞程序性死亡

为了检测小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell ,ES细胞 )体外分化的拟胚体 (embryoidbodies ,EBs)形成过程中细胞程序性死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的发生 ,通过悬滴、悬浮培养技术定向诱导未分化的ES细胞分化为拟胚体 ,并用RT PCR检测原始内胚层、原始外胚层、中胚层、内脏内胚层 4种分子标记物在EBs中的表达 .通过TUNEL染色、电镜、激光共聚焦显微镜及Western印迹以确定凋亡发生 .结果表明 :ES细胞体外分化为拟胚体并且表达各胚层相应的分子标记物 ;在拟胚体的发育过程中出现明显的空腔化过程 ,TUNEL染色及电镜观察到凋亡生成 ,同时线粒体膜电位 (ΔΨm)在拟胚体发育过程中降低 ,通过Western印迹检测到caspase3、caspase8的激活 .表明小鼠ES细胞所分化的拟胚体可以作为研究早期胚胎发育的实验模型 ,线粒体在拟胚体的细胞程序性死亡过程中发挥重要的作用 .为进一步利用拟胚体研究细胞程序性死亡及相关信号分子在小鼠胚胎发育早期的作用奠定了基础     

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。     

WDR1在PC9细胞对AZD9291抗性形成中的影响

[目的]探究WDR1在PC9细胞形成对AZD9291耐药中的作用。[方法]构建PC9耐奥西替尼(AZD9291)细胞株(PC9/AR),通过qRT-PCR和Western Blot检测PC9/AR细胞中WDR1的水平;通过siRNA敲降Wdr1后,用CCK8实验检测细胞存活率;在敲降Wdr1的基础上过表达cofilin,通过CCK8检测细胞的存活率;在PC9细胞中过表达Wdr1,在AZD9291的处理下检测细胞存活率。[结果]WDR1和Cofilin在PC9/AR细胞中与正常细胞相比蛋白水平上分别有2.5倍和1.5倍的上升;敲降Wdr1,细胞活性显著下降(P 0.05)。敲降Wdr1后,过表达cofilin,细胞的存活率显著提高(P 0.05)。[结论]WDR1能显著性增强PC9细胞对AZD9291的抗性,并且通过ADF/cofilin介导的肌动蛋白动力学来促进这一过程的。     

血管紧张素Ⅱ在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

为检测血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AⅡ）对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向心肌细胞方向分化的作用,采用10-4 mol/L维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞. Western印记检测胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中表达血管紧张素Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R).诱导分化期间用1 μmol/L AⅡ刺激胚胎干细胞,计数搏动拟胚体的比例;诱导分化第14 d用real-time RT-PCR 和Western 印记检测心肌标志物的表达确定其作用. 结果显示,与对照组相比,1 μmol/L AⅡ处理组可显著增加搏动拟胚体的比例,上调心肌标志物mRNA的表达. 预先用1 μmol/L洛沙坦处理1 h后可显著阻碍这种上调作用. 本实验结果表明,AⅡ通过AT1R可促进小鼠R1胚胎干细胞向心肌细胞分化.     

敲低低密度脂蛋白受体相关蛋白1抑制C3H10T1/2多潜能干细胞定向成脂

C3H10T1/2多潜能干细胞成脂过程分为定向和分化两个阶段,骨形成蛋白4(BMP4)可以诱导其定向成前脂肪细胞．已有的研究表明,脂肪组织特异性敲除低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)的小鼠体重减轻,脂肪组织含量减少,揭示此基因对成脂具有重要作用．然而,目前尚不清楚Lrp1是否在成脂定向过程中发挥作用．采用小干扰RNA技术(RNAi),在体外水平研究低密度脂蛋白Lrp1对C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向的作用．分别在C3H10T1/2成脂的定向期和脂滴成熟期敲低Lrp1,通过显微镜下观察、油红O染色、Western blotting等实验证实,定向期而非脂滴成熟期敲低Lrp1显著抑制C3H10T1/2多潜能干细胞成脂．BMP4通过激活下游Smad1/5/8信号通路发挥作用,而敲低Lrp1显著抑制BMP4诱导的Smad1/5/8磷酸化．这些结果说明：敲低Lrp1通过下调Smad信号通路,抑制BMP4诱导的C3H10T1/2多潜能干细胞成脂定向．     

三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制

目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TCE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响。结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物c Tn T表达随剂量的增加而显著降低。在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响。结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常。     

双三体胚胎干细胞的增殖与分化特征分析

该文旨在研究双三体胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)在细胞增殖、分化以及畸胎瘤形成等方面的特征,揭示非整倍体与肿瘤发生之间的关系。首先建立了两株常染色体双三体的小鼠ESC株系,通过微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization,array CGH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验对双三体ESC株系进行了染色体拷贝数分析和核型鉴定;通过绘制细胞生长曲线检测了双三体ESCs的增殖能力;通过流式细胞术检测了双三体ESCs的细胞周期和细胞凋亡情况;采用细胞克隆形成实验分析了双三体ESCs的克隆形成效率;通过实时荧光定量PCR和免疫荧光染色实验检测了双三体ESCs中多能干细胞标志物的表达;通过撤掉培养体系中的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)诱导分化和进行拟胚体(embryoid body,EB)形成实验检测了双三体ESCs的分化能力;通过重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠皮下接种细胞实验分析了双三体ESCs的畸胎瘤形成能力和体内分化能力。结果显示,这两株双三体细胞分别是3号与6号染色体双三体并伴有Y染色体丢失的ESCs(DTs-3+6),以及6号与8号染色体双三体的ESCs(DTs-6+8)。双三体ESCs表现出相对于野生型细胞较强的生长增殖能力和OCT4、SOX2、NANOG等多能干细胞标志物的高表达。当培养液中不添加LIF时,野生型细胞基本完全走向分化,而双三体细胞形成许多未分化或部分分化的克隆,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色阳性。在EB分化早期,双三体细胞中Fgf5、T、Foxa2等三胚层标志物的表达水平较野生型细胞明显降低,分化滞后。当被接种到SCID小鼠皮下后,双三体ESCs形成畸胎瘤的能力较野生型细胞增强,畸胎瘤中包含大量未分化区域。因此,双三体ESCs的生长增殖能力增强,它通过限制细胞分化能力而促进畸胎瘤形成。双三体ESCs是研究非整倍体在肿瘤发生发展过程中作用的重要模型。     

Id2诱导Myc表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新

小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)分离自小鼠的囊胚内细胞团,在体外具有无限的自我更新能力和多向分化的潜能,因此拥有重大的社会和经济效益.前期人们发现,DNA结合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,Id1)在含血清培养条件下,可以促进m ESCs自我更新,但其家族成员,如Id2和Id3,在m ESCs中的作用尚不清楚.本课题在m ESCs里分别上调Id2和Id3基因的表达,发现它们在含血清的培养条件下均具有促进m ESCs自我更新的能力,但Id2促进自我更新的能力大于Id3.通过转录组测序技术发现Id2上调c-Myc和n-Myc基因的表达水平.最后功能性验证实验证实,只有同时干扰c-Myc和n-Myc基因的表达才能够极大地削弱Id2维持m ESCs未分化状态的作用,表明Id2主要通过诱导Myc家族成员的表达来促进m ESCs的自我更新.本研究结果将扩大人们对干细胞多能性调控网络的认识,利于干细胞未来的基础研究和安全应用.     

敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖

细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道。构建Wdr1条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况。PCR结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠模型构建成功。免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞。细胞形态观察结果显示:Wdr1敲除后对细胞的形态有显著性影响。同时,划痕实验以及CCK8检测结果也表明:Wdr1的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖。Wdr1敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义。     

组蛋白去乙酰化酶在间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化过程中的表达及HDAC11的作用

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)通过调节组蛋白乙酰化修饰参与调控基因表达.研究发现多种HDAC参与成脂分化,但其机制尚不清楚.本研究探讨间充质干细胞C3H10T1/2成脂分化过程中HDAC的表达变化及其对成脂分化的影响.本研究首先建立了C3H10T1/2体外成脂分化的模型,并以油红O染色鉴定成功诱导成脂分化.PCR检测C3H10T1/2细胞成脂分化过程中11种HDAC的变化趋势,发现成脂分化过程中,HDAC1、2、5、9和10的m RNA表达量下降,而HDAC3、6、8和11的m RNA表达量明显上升,其中HDAC11上升最为显著.进一步通过RNA干扰沉默HDAC11表达,PCR检测成脂分化的关键转录因子PPARγ2和成脂标志物Perilipin、Adipoq的m RNA表达量下降,但Fabp4表达变化不明显.油红O染色结果表明,诱导C3H10T1/2成脂分化过程中,干扰HDAC11表达,胞浆内脂滴形成数量减少,成脂分化受到抑制.实验结果提示,C3H10T1/2细胞成脂分化伴随着多种HDAC表达的变化,其中HDAC11的增加最显著,干扰HDAC11的表达可以抑制C3H10T1/2细胞的成脂分化.     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

胚胎干细胞在体外模拟心肌生长环境中向心肌分化

目的:探讨获得大量成熟同质有功能的心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的方法.方法:胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)经悬滴培养法形成拟胚体(embryoid bodies,EBs),将EBs用抗坏血酸处理后与天然心肌细胞共培养诱导ESCs的分化,采用免疫组化、流式细胞技术、RT-PCR、超微分析等方法分析分化细胞(ESC-derived CMs,ESCMs)的结构和功能.结果:共培养组,常规组和对照组中有(90.1±3.40)%,(29.6±6.03)%和(20.1±3.82)%的EBs表现节律性收缩,差异有统计学意义(P＜0.05).在体外模拟的心脏微环境中,不但跳动EBs的数目明显增加,且单个跳动EBs中含有功能CMs的百分比也明显增加.兴奋收缩的自律性能维持更长时间,在后期分化得到的有功能ESCMs在细胞形态上接近于天然的心肌细胞.结论:心脏微环境是促使ESCs特定地分化为CMs的关键因素,抗坏血酸处理和共培养诱导策略可使ESCs定向分化为CMs.     

MicroRNA对胚胎干细胞的多能性网络调控

胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)是一类能够无限增殖和诱导分化为多种类型细胞的干细胞。MicroRNA(miRNA)是一类内源性具有调控基因表达功能的非编码RNA, 在ESCs增殖和分化过程中起重要作用。MiRNA可以通过对ESCs多能性网络中的转录因子、细胞周期、表观遗传学、信号转导等方面调控, 促使ESCs维持多能性状态。文章重点综述了miRNA的生成过程、调控ESCs多能性的主要miRNA家族以及miRNA对ESCs多能性网络调控作用等内容。     

Gadd45g诱导小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化

为探究生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45γ(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma,Gadd45g)对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)在体外培养条件下自我更新状态的影响,通过设计并构建含有Gadd45g基因的重组质粒,将其导入m ESCs内,过表达目标基因;在含有白血病抑制因子(LIF)的血清培养条件下,通过细胞计数、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR以及免疫荧光等实验手段检测m ESCs的生长情况。结果显示,与对照组相比,过表达Gadd45g基因后,m ESCs的生长速度减缓,碱性磷酸酶活性降低,且中内胚层标志基因的表达水平显著上升。进一步研究发现,在添加LIF的有血清或2i无血清培养体系中,过表达Gadd45g均可以降低细胞内STAT3蛋白的磷酸化水平,由此推断上调Gadd45g的表达会抑制STAT3的活性,从而推动m ESCs向中内胚层分化。研究结果扩大了目前人们对于ESCs分化机制的理解,有利于胚胎干细胞未来的基础研究与安全应用。     

小鼠胚胎干细胞体外分化形成新生血管的实验研究

目的探讨小鼠胚胎干细胞(ES)在体外向内皮细胞(ECs)分化并形成新生血管的条件及特点。方法分别建立二维和三维小鼠ES细胞分化体系,对分化细胞行血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)免疫荧光染色和DiI-乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)标记,观察ECs分化及血管形成特点。结果在二维分化体系,ES细胞在无外源性生长因子存在的条件下可自发向ECs分化,ECs主要定位在分化细胞密集处,分化表现为:ECs呈集落样生长,不形成网状结构;ECs互相连接形成网状结构,PECAM-1免疫荧光染色证实为ECs网。在三维的悬浮拟胚体培养体系,ECs的分化不依赖于外源性生长因子,分化表现为条索状结构、管腔样结构及排列紊乱的细胞团三种形式。对该拟胚体的冷冻切片进行的三维图像重构显示,拟胚体中有大量的血管网形成。在三维的Ⅰ型胶原培养体系中,ES形成的拟胚体表现为出芽式血管新生,这一过程依赖于外源性生长因子混合物。结论在二维和三维ES细胞分化体系中,ECs分化及新生血管形成过程与体内相似,表现为血管生成和血管新生两种形式,因此可作为研究血管发育机制的理想模型。     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

敲低HSP60 对结肠癌SW480 细胞增殖能力的影响及其机制探究

目的:研究热休克蛋白60(HSP60)敲低对结肠癌SW480细胞增殖的影响,并进一步探究其作用机制。方法:通过含HSP60sh RNA载体的慢病毒感染加上流式细胞仪无菌分选的方法构建结肠SW480 HSP60基因稳定RNA干扰(RNAi)单克隆细胞系,利用Western blot和q-PCR验证结肠癌细胞中HSP60的敲低效率;使用CCK-8试剂检测结肠癌细胞增殖能力,并用流式细胞仪检测其HSP60敲低对细胞周期的影响。结果:Western blot和q-PCR结果验证了HSP60在结肠癌细胞中的敲低效率,与对照组细胞相比,实验组细胞HSP60的m RNA水平和蛋白水平均降低了60%以上。CCK-8实验结果表明,敲低HSP60后SW480细胞的增殖能力下降了约70%;流式细胞周期实验显示敲低HSP60后SW480细胞中G0/G1期、S期、G2/M期的分布比例变化不大。结论:敲低HSP60能够显著抑制SW480细胞的增殖能力,而SW480细胞周期并没有发生明显变化,推测HSP60的敲低引起的线粒体损伤导致细胞生长速度变慢。     

切割HPV-6bE1和HPV-11E1通用核酶Rz 1282的体外活性鉴定

利用计算机分析 HPV- 6b E1和 HPV- 1 1 E1 m RNA的同源序列 ,设计出通用于两者的锤头状核酶—— Rz1 2 82 (HPV- 6b基因 1 2 82位 ) ,通过体外转录建立了体外大量制备 Rz1 2 82的方法 .体外的切割实验表明 ,Rz1 2 82可在体外准确和有效地切割 HPV- 6b/1 1 E1靶 RNA,形成 2 68nt/52nt和 2 31 nt/52 nt大小的切割产物 .对于 HPV- 6b,Km和 kcat值分别为 1 3.8nmol/L和 0 .0 7min-1;对于 HPV- 1 1 ,Km 和 kcat值分别为 2 3.0 nmol/L和 0 .2 4 min-1.结果表明 ,体外制备的 Rz1 2 82具有较好的特异催化切割活性 ,并通用于 HPV- 6b及 HPV- 1 1 .它有望发展成为在细胞内有效抑制HPV- 6b/1 1 DNA复制的核酸药物 .     

GTF2H2通过介导AKT信号通路影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移*

目的:探讨通用转录因子II H亚基2(GTF2H2)是否影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移及其潜在的分子机制。方法:通过转染GTF2H2-siRNA构建GTF2H2敲低的Hep3B肝癌细胞模型;实时定量聚合酶链反应(q-RT-PCR)和蛋白质印迹实验检测肝癌细胞Hep3B的GTF2H2敲低效果;细胞计数实验(MTS)检测GTF2H2敲低的肝癌细胞Hep3B的增殖能力;Transwell细胞迁移实验检测GTF2H2敲低的肝癌细胞Hep3B的迁移能力;蛋白质印迹分析实验检测GTF2H2敲低后是否影响肿瘤相关分子信号通路。结果: GTF2H2敲低组的Hep3B细胞的增殖能力较对照组的Hep3B细胞增强,迁移能力亦有增强;蛋白质印迹实验显示GTF2H2敲低后,p-AKT通路蛋白的表达明显升高。结论:GTF2H2可能通过介导AKT分子信号通路,影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移能力。     

高迁移率族蛋白成员HMG20a/b的研究进展

高迁移率族(HMG)蛋白是一类广泛存在的非组蛋白型染色体蛋白,能通过诱导染色质结构的变化影响DNA表达。HMG20a和HMG20b是一对高度同源的HMG家族蛋白,均含有一个结构保守的HMG-box结构域和一个coiled-coil结构域,在生物体内广泛表达。HMG20a/b在细胞核内参与组蛋白去甲基酶复合物LSD1-Co REST的形成及一系列与细胞分裂分化相关的生理进程,如神经细胞核红细胞的分化、细胞质分裂以及EMT过程。研究发现,HMG20a/b一些功能的发挥是通过LSD1-Co REST复合物来实现的;在神经分化过程中,HMG20a、HMG20b具有相互拮抗的作用;而HMG20a促进EMT过程反映它很可能是一个促癌因子。本文对HMG20a/b的结构和体内分布及生物学功能进行综述。