树免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树鼩对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树鼩是否可以感染HIV-1,利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株,体外感染云南野生成年树鼩的淋巴细胞和单核/巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用PCR法未能发现树鼩的这些免疫细胞中有前病毒DNA,用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树鼩细胞的表面检测到特异抗原;而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树鼩的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1,可能的原因是树鼩的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

树qu免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿，这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此，寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树qu对许多重要的医学病毒易感，为了探讨树qu是否可以感染HIV-1，利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株，体外感染云南野生成年树qu的淋巴细胞和单核/巨噬细胞；同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在，用PCR法未能发现树qu的这些免疫细胞中有前病毒DNA，用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树qu细胞的表面检测到特异抗原；而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树qu的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1，可能的原因是树qu的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

树Ju免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了ＨＩＶ－１的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染ＨＩＶ－１的动物模型成为十分迫切的课题。已知树Ｊu对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树Ｊu是否可以感染ＨＩＶ－１,利用不同辅助受体的５种ＨＩＶ－１病毒株。体外感染云南野生成年树Ju的淋巴细胞和单核／巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ和流式细胞术分别进行了检测,用ＲＴ－ＰＣＲ方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用ＰＣＲ法未能发现树Ｊu的这些免疫细胞中有前病毒ＤＮＡ,用流式细胞术也未能在这些感染ＨＩＶ－１的树Ｊu细胞的表面检测到特异抗原;而感染ＨＩＶ－１的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树Ju的这些免疫细胞在体外未能感染上ＨＩＶ－１,可能的原因是树Ｊu的这些免疫细胞的ＨＩＶ－１受体（ＣＤ４）和辅助受体（ＣＣＲ５或ＣＸＣＲ４）与人的免疫细胞胞差别较大。     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

雌激素受体在人舌鳞癌中的表达及β-雌二醇对其增殖的影响

目的：观察雌激素受体（ER）在人舌鳞癌Tca8113细胞系细胞上的表达,研究β－雌二醇（estrabiol,E2)对培养的舌癌细胞增殖的影响。方法：用免疫细胞化学方法和RT－PCR方法检测雌激素受体在人舌鳞癌细胞上的表达,将β－雌二醇（β－E2）作用于体外培养的人舌鳞癌细胞,测定^3H-TdR掺入量,并用流式细胞仪测定细胞周期。结果：经免疫细胞化学和RT－PCR方法可检测到ER－α和ER－β在人舌鳞癌细胞上均有表达,其中ER－β表哒相对较弱。不同浓度的β－E2可增加^3H-TdR掺入量,并存在着剂量效应。106-6mol/L的β－E2能使人舌鳞癌细胞处于G1期的细胞比例从对照组的76．5％下降至62．3％,而处于S期和G2期的细胞比例从23．5％上升至37．7％,细胞的DNA合成增加,促进细胞的增殖。β－E2对舌癌细胞的促增殖作用可被Tamoxifen阻断。结论：在人舌鳞癌细胞上有雌激素受体的表达,且β－E2在体外能明显促进培养的人舌鳞癌细胞的增殖。     

CA16感染树鼩肺成纤维细胞模型的建立及其受体SCARB2的表达

目的 探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法 用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB2蛋白的表达情况,探针法实时荧光定量PCR检测病毒载量,以β-Actin作内参染料法实时荧光定量PCR检测受体SCARB2基因的相对表达量,结合基因序列比对,分析其与感染的相关性。结果 CA16感染TSLF,可引起明显的细胞病变,免疫荧光实验可见病毒和受体SCARB2蛋白,以100TCID50/10^5 cells的比例感染TSLF可在48 h左右病毒载量达到最高,SCARB2基因有与感染相关的高表达,而其基因序列也与人有较高同源性。结论 CA16可感染TSLF,树鼩SCARB2可参与感染。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

树鼩CXCR4 cDNA的克隆和序列分析

目的　获得树CXCR4的cDNA序列 ,探讨其是否可以支持HIV_1病毒和细胞的结合。方法　设计相应的引物 ,用RT_PCR ,基因克隆 ,DNA序列分析技术。结果　获得了全长为 10 59bp树CXCR4(tsCXCR4)基因的cDNA。发现其核苷酸序列与人的CXCR4(hCXCR4)基因的cDNA有 92 8%的相似性 ,由此推导出的氨基酸序列有 96 9%相似性。与hCXCR4功能相关的关键位点完全相同 ,tsCXCR4的N端第 7和 12位点为酪氨酸 ,第 14、15和3 2位点为谷氨酸 ,胞外环第 183 ,188为精氨酸 ,第 193、2 62位点以及跨膜区 97位点为天冬氨酸。结论　树的CX CR4很可能会作为HIV_1的辅助受体     

病毒性趋化因子vMIP2的表达、纯化及生物活性研究

趋化因子受体如CCR5和CXCR4是HIV侵入细胞的辅助受体,趋化因子与其受体的结合可以抑制HIV感染细胞。近年来在疱疹病毒8(Human herpesvirus8,HHV8)基因组中发现与人趋化因子有较高同源性的开放阅读框,分别命名为vMIP1、vMIP2和vMIP3。研究发现vMIP2与多种人趋化因子受体有高亲和力。本研究在大肠杆菌中表达出融合蛋白TrxA—vMIP2,用亲和层析的方法对其纯化。纯化产物用肠激酶酶切后,经离子交换层析纯化出目的蛋白vMIP2。体外活性研究表明纯化的vMIP2可以有效地抑制R5和X4 HIV—1在人外周血单核细胞上的复制。     

病毒性趋化因子vMIP2的表达、纯化及生物活性研究

趋化因子受体如CCR5和CXCR4是HIV侵入细胞的辅助受体,趋化因子与其受体的结合可以抑制HIV感染细胞.近年来在疱疹病毒8(Human herpesvirus 8, HHV8)基因组中发现与人趋化因子有较高同源性的开放阅读框,分别命名为vMIP1、vMIP2和vMIP3.研究发现vMIP2与多种人趋化因子受体有高亲和力.本研究在大肠杆菌中表达出融合蛋白TrxA- vMIP2,用亲和层析的方法对其纯化.纯化产物用肠激酶酶切后,经离子交换层析纯化出目的蛋白vMIP2.体外活性研究表明纯化的vMIP2 可以有效地抑制R5和X4 HIV-1在人外周血单核细胞上的复制.     

用腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子受体KDR胞外区基因的有达

新生血管大量形成在实体瘤的生长和转移中起着关键的作用。血管内皮生长因子 (VEGF)是介导肿瘤血管生成的最主要因素。从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)提取细胞总RNA ,采用逆转录PCR(RT PCR)方法得到VEGF受体KDR胞外区cDNA片段。将获得的受体基因克隆到AAV基因治疗载体pSNAV中 ,得到重组质粒pSNAV KDR。重组质粒转染BHK细胞 ,加入辅助病毒后 ,获得了表达目的蛋白的重组AAV。重组病毒表达的KDR在体外实验中具有与VEGF结合的活性。在体内实验中 ,重组AAV感染的黑色素瘤细胞在小鼠中形成肿瘤的血管化程度明显低于对照组。     

HIV/AIDS的细胞治疗

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的危险性极高的慢性传染病。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)能够阻断正在进行的病毒复制而不能清除潜伏的病毒,目前尚无有效根治AIDS方法。免疫细胞在HIV/AIDS发展过程的不同阶段发挥着十分复杂的作用。细胞治疗是通过筛选表达抗HIV基因型的细胞或转染抗HIV基因、受体基因等方法获得抗HIV免疫细胞,并在体外进行扩增,将其转输给HIV/AIDS患者。细胞疗法与HAART等疗法有协同作用,促进HIV/AIDS的治疗。本文综述抗HIV-CAR T细胞、aTCR T细胞、负载HIV抗原的树突状细胞等在HIV/AIDS治疗中的应用及其疗效。     

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .体外感染实验的成功为进一步进行基因治疗动物实验打下了基础     

人免疫缺陷病毒的受体与辅助受体

人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是引起艾滋病的病原.由于该病的病死率较高,目前尚没有被广泛接受的有效的医治方法,所以世界各国对艾滋病都十分重视.在感染HIV时,HIV首先与靶细胞上的受体(receptor)结合后,才能进入该细胞并在其内繁殖.所以充分地了解HIV的受体及辅助受体(coreceptor),对控制HIV的感染和传播是至关重要的.     

GBV-C/HIV共感染对AIDS疾病进程和HIV病毒复制的影响

近年来,一些研究发现,GBV-C/HIV共感染可延缓HIV感染疾病的进程,然而也有一些研究得出不同的结论.本研究收集我国安徽省阜阳市HIV血清学阳性的既往献血员血浆标本,对其进行GBV-C感染的检测,研究GBV-C/HIV共感染与HIV病毒载量和CD4 T淋巴细胞绝对计数的关系.用RT-PCR和酶联免疫法检测,在203人中检出GBV-C感染52例,显示该人群GBV-C的感染率为25.6%,男性感染者(35例,67.3%)高于女性感染者(17例,32.7%).分析发现,GBV-C感染与未感染两组患者的CD4 T淋巴细胞绝对计数和HIV病毒载量数据均无统计学差异.本研究中的HIV-1感染者均未接受ART治疗,因而排除了治疗对疾病进展的影响.研究结果显示,在HIV-1感染晚期的献血人群,GBV-C/HIV共感染对CD4细胞和病毒复制水平无显著影响.由于本研究对象中无HIV-1早期感染者,因而不能判断GBV-C在HIV-1感染的早期对疾病进展有无影响.     

腺病毒、腺相关病毒载体转导心肌细胞的研究

目的和方法：构建含人β2肾上腺素能受体（β2－AR）基因的重组腺病毒(rAd) 和腺相关病毒（rAAV),并感染体外培养的心肌细胞,检测目的基因在心肌细胞内的表达。结果：RT－PCR检测结果显示感染的心肌细胞均表达人β2-ARmRNA,western印迹杂交显示感染的心肌细胞可表达人β2－AR蛋白;放射性配基检测表明两种重组病毒感染的心肌细胞的β－AR密度无明显差异（P＞0．05）,但均高于对照组（P＜0．01）。结论：腺相关病毒（AAV）载体与腺病毒载体均中有效的转染心肌细胞并使目的基因表达。     

中国人艾滋病毒感染者及健康人群人类免疫缺陷病毒CCR5开放阅读框架区天然突变的对比研究

目的 研究中国人群CCR5基因开放阅读框架(ORF)区突变并分析其对中国人人类免疫缺陷病毒(HIV)传播和致病的影响。方法 研究对象为居住在香港特区的1099名成年中国人,其中785名为HIV阴性健康人,314例为确诊HIV感染的患者。首先对CCR5 ORF进行测序,确定并分析CCR5突变在人群的分布。再对突变G106R、Δ32、R223Q、299(FS)和S3361体外克隆,研究其表达及作为HIV辅助受体功能的改变。结果 在CCR5 ORF共检测到10个突变位点。其中7个为有意义突变;突变R223Q是发生频率最高的突变,在正常人是4．7％,在HIV感染者是4．5％;其余CCR5 ORF突变发生频率均＜1％; R223Q位于CCR5膜内区,不影响其作为HIV辅助受体的功能;S336I位于CCR5的C端,同样不影响其功能;突变G106R位于CCR5第3跨膜区,实验显示其辅助受体功能受到明显影响。结论 CCR5 ORF突变在中国人群较为常见,一些突变明显影响其作为HIV辅助受体的功能,但在流行病学范围内对HIV感染及致病的影响不明显。     

广谱趋化因子受体结合物-vMIP-II的体内抗SIV功能研究

病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-II)是一种广谱趋化因子受体拮抗剂,它所拮抗的趋化因子受体被认为是不同的人免疫缺陷病毒株(Human immunodeficiency virus,HIV)进入靶细胞的辅受体。虽然理论上vMIP-II是一个广谱的HIV抑制剂,但vMIP-II的抗HIV感染作用却少有报道,特别是体内研究。本研究利用一个有效的SIV-mac251感染食蟹猴模型来评价vMIP-II的体内抗HIV感染作用,结果显示vMIP-II能够有效地并呈剂量依赖性地降低食蟹猴血浆病毒载量,同时对宿主免疫功能具有保护作用。这些结果表明vMIP-II是一种有效的抗HIV物质,可以作为一类新型的抗HIV先导药物,也为研发靶向病毒进入的新药提供了进一步的理论支持。     

广谱趋化因子受体结合物-vMIP-Ⅱ的体内抗SIV功能研究

病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)是一种广谱趋化因子受体拮抗剂,它所拮抗的趋化因子受体被认为是不同的人免疫缺陷病毒株(Human immunodeficiency virus,HIV)进入靶细胞的辅受体.虽然理论上vMIP-Ⅱ是一个广谱的HIV抑制剂,但vMIP-Ⅱ的抗HIV感染作用却少有报道,特别是体内研究.本研究利用一个有效的SIV-mac251感染食蟹猴模型来评价vMIP-Ⅱ的体内抗HIV感染作用,结果显示vMIP-Ⅱ能够有效地并呈剂量依赖性地降低食蟹猴血浆病毒载量,同时对宿主免疫功能具有保护作用.这些结果表明vMIP-Ⅱ是一种有效的抗HIV物质,可以作为一类新型的抗HIV先导药物,也为研发靶向病毒进入的新药提供了进一步的理论支持.