抗猪PD-L1单克隆抗体的制备与其生物学特性鉴定

本研究旨在制备抗猪PD-L1单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab),有助于阻断猪PD-1/PD-L1通路逆转免疫功能。免疫原为猪PD-L1胞外区重组蛋白,雌性BALB/c鼠为免疫动物,用淋巴细胞杂交瘤技术将鼠骨髓瘤细胞NS0和免疫BALB/c鼠脾细胞融合,ELISA法筛选及多次克隆化培养,筛选抗猪PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株。成功制备1株能稳定分泌抗猪PD-L1的mAb的杂交瘤细胞株3B5,Ig亚型为IgG1,细胞上清和腹水效价分别为1:1×2~(10)和1:1.024×10~5,ELISA和Western-blotting结果表明该株单抗能特异性识别猪重组PD-L1蛋白,流式细胞术结果表明该单抗可以与猪PBMC上PD-L1蛋白有效结合,成功制备了1株分泌抗猪PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B5,为检测猪PD-L1蛋白表达水平及猪PD-1通路在猪传染性疾病中的致病机制提供有力的检测工具。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

制备抗羊口疮病毒118(ORFV118)重组蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性。构建ORFV118原核表达重组质粒pET33b-ORFV118,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达出ORFV118重组蛋白;利用Ni-NTA亲和层析法纯化ORFV118重组蛋白;以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体;利用间接ELISA法、Western blot、免疫组化等方法分别对单抗特异性、效价、亚型以及ORFV118蛋白的功能进行研究。获得了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1A2,3B5,5D10,它们诱生的小鼠腹水效价分别为110 000,16 400,18 000。其中效价最高的1A2抗体亚型为IgG1,能特异性结合其免疫原蛋白、真核表达产物以及病羊皮肤组织中的ORFV118蛋白。免疫组化结果显示单抗1A2染色局限于皮肤表皮层角化细胞及浸润至皮下组织的炎症细胞,与病毒侵染上皮组织层的特性相符。制备的单抗1A2能特异性识别ORFV118。深入研究单抗1A2将为了解ORFV118的生物学特性,为羊传染性脓疱病的诊断、预防与治疗提供可能和新思路。     

抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析

为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株。用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析。结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白(Glycoprotein,GP)单抗和7株稳定分泌抗核蛋白(Nucleoprotein,NP)单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性。抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)滴度在1 280~20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性。获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120~20 480,均无中和活性。此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗(1C8和1G8)均有较高亲和力。本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,融合阳性细胞用间接ELISA方法检测,阳性细胞株经三代克隆纯化后,获得三株能稳定分泌抗CIAV VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为AG2、BC11、FG1。三株杂交瘤细胞株产生的细胞培养液上清和小鼠腹水的ELISA效价分别为2.5ⅹ102、1.5ⅹ102、1ⅹ102和2ⅹ106、1ⅹ106、2.5ⅹ105。与其它禽类病毒的交叉实验表明：这三株单抗具有良好的抗CIAV VP3蛋白特异性。该特异性单克隆抗体的研制成功为进一步研究VP3的生物学特性打下了基础。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的原核表达及其单克隆抗体的研制

摘要　目的　利用原核表达系统表达猪脑心肌炎病毒 (EMCV) 非结构蛋白3AB,并通过杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体,为相关研究工作奠定基础。方法　利用大肠杆菌系统表达具有良好抗原性的重组3AB蛋白,经包涵体纯化后免疫BALB/ c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞, 并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定。 结果　经间接ELISA 筛选阳性的杂交瘤细胞, 获得1株能稳定分泌抗3AB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2D12,其亚类测定为IgG1 /κ。Western Blot和间接免疫荧光试验证明该单抗能特异性识别3AB蛋白。结论　成功获得了针对EMCV-3AB 的特异性单抗,为进一步研究猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定必要的物质基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽(hCGβ-CTP)单克隆抗体制备及初步鉴定

本研究以重组人促红素-CTP融合蛋白(EPO-CTP)进行真核表达,获得纯品蛋白,免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株可稳定分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽(h CGβ-CTP)的杂交瘤细胞株,命名为E4。ELISA鉴定结果表明,单抗的亚型为Ig G1,轻链为K链,腹水效价都在5×10-5以上。从而为验孕产品特异性的提高和以连接CTP的融合蛋白药物的研制提供物质基础。     

抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立

制备抗登革病毒NS1蛋白单克隆抗体,建立检测NS1的ELISA方法。表达1~4型登革病毒NS1蛋白,将1型NS1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。经ELISA、Western blotting、间接免疫荧光筛选和鉴定单克隆抗体,进行纯化和HRP标记。通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用,选择非竞争单抗组合并建立NS1捕获法ELISA。结果获得7株高滴度抗NS1单抗,捕获法ELISA可以检出10ng/mL NS1。原核表达登革病毒NS1蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应,NS1捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测。     

牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

利用牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)接种牛肺细胞(BL),提取病毒RNA。通过RT-PCR扩增BRSV的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pET30a,获得重组表达质粒pET30a-N。将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),经增菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,成功表达出了核蛋白(N),其分子量约为49kDa。为制备BRSV核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。采用以BRSV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗N特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2D12与4B10。用2D12与4B10杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rN及BRSV包被的ELISA测得的效价分别是1×105和1×106及1×102和1×103。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定D12与4B10均为IgG1/κ。特异性试验表明单抗2D12与4B10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的D12与4B10可用于建立检测BRSV病原及抗体的诊断方法。     

DNA immunization with a plasmid carrying the gene of hepatitis C virus protein 5A (NS5A) induces an effective cellular immune response

In spite of extensive research, no effective vaccine against hepatitis C virus (HCV) has been developed so far. DNA immunization is a potent technique of vaccine design strongly promoting the cellular arm of immune response. The genes encoding nonstructural HCV proteins (NS2-NS5B) are promising candidates for vaccine development. NS5A is a protein involved in viral pathogenesis, in the induction of immune response, and probably in viral resistance to interferon treatment. The objective of this study was to construct a DNA vaccine encoding NS5A protein and evaluate its immunogenicity. A plasmid encoding a full-size NS5A protein was produced using the pcDNA3.1 (+) vector for eukaryotic expression system. The expression of the NS5A gene was confirmed by immunoperoxidase staining of the transfected eukaryotic cells with anti- NS5A monoclonal antibodies. Triple immunization of mice with the plasmid vaccine induced a pronounced cellular immune response against a broad spectrum of NS5A epitopes as assessed by T-cell proliferation and secretion of antiviral cytokines IFN-γ and IL-2. In T-cell stimulation in vitro experiments, NS5A-derived antigens were modeled by synthetic peptides, recombinant proteins of various genotypes, and phages carrying exposed NS5A peptides. A novel immunomodulator Immunomax showed high adjuvant activity in DNA immunization. The data obtained indicate that the suggested DNA construct has a strong potential in the development of the gene vaccines against hepatitis C.     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

Expression of the NS1 gene of tick-borne encephalitis virus in gram-negative bacteria from the mouse nasopharynx

Bacteria were isolated from the nasopharynx of BALB/c mice and electroporated with pUR290(NS1)2 containing two copies of tick-borne encephalitis virus (TBEV) strain Sofjin NS1 under the control of the lac promoter. The plasmid persisted in transformants for at least ten passages. The NS1 gene expression was detected in Gram-negative enterobacteria via immunoblotting with monoclonal antibodies against TBEV nonstructural glycoprotein NS1. Recombinant NS1 was detected in bacterial cells and in the culture medium. Intranasal immunization with recombinant bacteria activated production of antibodies against NS1 in serum of BALB/c mice. The humoral immune response to NS1 failed to protect immunized mice from a TBEV challenge.     

重组恶性疟原虫DNA质粒免疫小鼠制备单克隆抗体

用恶性疟原虫MSP131基因片段的重组质粒DNA直接免疫BALB/c小鼠,诱导产生体液,免疫后取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1450作用下进行融合,获得了2株能分泌抗恶性疟原虫MSP131单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株9H9和8A2。用酶联免疫吸附试验检测,小鼠腹水抗体滴度最高为1∶10 000。经免疫球蛋白类型和亚类鉴定,2株杂交瘤细胞株均为IgG\-1\.蛋白免疫印迹试验表明,此单克隆抗体与MSP1\|31蛋白抗原有特异免疫反应,证明通过质粒DNA直接免疫小鼠可制备特异性单克隆抗体。     

抗人IgM单克隆抗体的研究—脾内免疫建立抗人IgM单克隆抗体杂交瘤细胞株

用多发性骨髓瘤病人血清中提纯的ＩｇＭ抗原,用脾内免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后与Ｓｐ２／Ｏ骨髓瘤细胞融合,获得了７株分泌人ＩｇＭ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为２５Ｇ１、２５Ｇ３、２５Ｇ４、２５Ｇ５、２５Ｄ２、２５Ｄ３和２５Ｄ５。注射同系小鼠后可诱生含较高效价抗人ＩｇＭ腹水（ＰＨＡ＝１２１２）。该杂交瘤细胞经组织培养传代半年,冻存１４个月后复苏,其分泌ＩｇＭ性能稳定。用ＰＨＡ、ＥＬＩＳＡ做人ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ阻断试验,仅ＩｇＭ可阻断。用琼脂糖双扩散证明其与羊抗人ＩｇＭ有共同沉淀线     

Expression of the Tick-borne Encephalitis Virus NS1 Gene in Gram-Negative Bacteria from the Mouse Nasopharynx

Bacteria were isolated from the nasopharynx of BALB/c mice and electroporated with pUR290(NS1)₂ containing two copies of tick-borne encephalitis virus (TBEV, strain Sofjin) NS1 under the control of the lac promoter. The plasmid persisted in transformants for at least ten passages. The NS1 gene expression was detected in Gram-negative enterobacteria by immunoblotting with monoclonal antibodies against the TBEV nonstructural glycoprotein NS1. Recombinant NS1 was detected in bacterial cells and in the culture medium. Intranasal immunization with recombinant bacteria caused antibodies against NS1 to appear in the serum of BALB/c mice. However, the humoral immune response to NS1 failed to protect mice from a TBEV challenge.     

重组人瘦素蛋白纯化鉴定及其单克隆抗体制备

大肠杆菌（E.coli）重组表达获得的重组人瘦素蛋白（rh-leptin）,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot印迹杂交鉴定其免疫学活性,免疫小鼠后制备单克隆抗体,结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学活性的rh-leptin蛋白,并获得一株稳定分泌抗rh-leptin单抗的杂交瘤细胞株。瘦素蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备,可供瘦素进一步研究应用。     

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1( )质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。     

Inhibitor of κB kinase epsilon (IKK(epsilon)), STAT1, and IFIT2 proteins define novel innate immune effector pathway against West Nile virus infection

West Nile virus is an emerging virus whose virulence is dependent upon viral evasion of IFN and innate immune defenses. The actions of IFN-stimulated genes (ISGs) impart control of virus infection, but the specific ISGs and regulatory pathways that restrict West Nile virus (WNV) are not defined. Here we show that inhibitor of κB kinase ε (IKKε) phosphorylation of STAT1 at serine 708 (Ser-708) drives IFIT2 expression to mediate anti-WNV effector function of IFN. WNV infection was enhanced in cells from IKKε(-/-) or IFIT2(-/-) mice. In IKKε(-/-) cells, the loss of IFN-induced IFIT2 expression was linked to lack of STAT1 phosphorylation on Ser-708 but not Tyr-701 nor Ser-727. STAT1 Ser-708 phosphorylation occurs independently of IRF-3 but requires signaling through the IFN-α/β receptor as a late event in the IFN-induced innate immune response that coincides with IKKε-responsive ISGs expression. Biochemical analyses show that STAT1 tyrosine dephosphorylation and CRM1-mediated STAT1 nuclear-cytoplasmic shuttling are required for STAT1 Ser-708 phosphorylation. When compared with WT mice, WNV-infected IKKε(-/-) mice exhibit enhanced kinetics of virus dissemination and increased pathogenesis concomitant with loss of STAT1 Ser-708 phosphorylation and IFIT2 expression. Our results define an IFN-induced IKKε signaling pathway of specific STAT1 phosphorylation and IFIT2 expression that imparts innate antiviral immunity to restrict WNV infection and control viral pathogenesis.     

用核酸免疫技术制备抗丙肝病毒C区单克隆抗体

用丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１区真核表达质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１按４００ｕｇ／只剂量免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,１４周后同一剂量再加强免疫一次。加强免疫后２周,在５０％ＰＥＧ１４５０介导下将脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞（５１）融合。实验结果融合率达５４．３％（３１３／５７６）。阳性率为５．４％（１７”３１３）。克隆化后得到６株稳定分泌抗丙肝病毒Ｃ区单克隆抗体杂交瘤细胞株。这６株杂交瘤均产生ＩｇＭ抗体,接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后产生腹水的效价为１６４－１３２０（ＥＬＩＳＡ）。