小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

克服昆明小鼠体外受精卵发育阻滞方法的研究

本研究应用CZB和WM培养液进行昆明小鼠体外受精胚胎的发育培养,建立了一个可行的胚胎体外培养的新方法,并通过改变培养液的成分及其含量,对胚胎发育的阻滞机理和突破方法进行了初步的探索。培养于WM中的受精卵发生阻滞,有48％停留于2细胞阶段;而CZB中的胚胎有81％发育为桑椹胚和囊胚。在WM中添加EDTA和谷氨酰胺得到了66％的囊胚;加大WM中乳酸钠和丙酮酸钠的比值未能克服发育的阻滞现象。实验结果表明,EDTA和谷氨酰胺在克服阻滞时具有协同作用。     

绵羊体外受精卵的发育及冷冻保存的研究

本研究主要探讨了绵羊体外受精卵在不同培养条件下的发育能力,并对体外发育至桑椹胚或囊胚的体外受精胚进行了冷冻保存。 从采自屠宰场的绵羊卵巢中采集卵母细胞,用含有10％FCS(或NSS)、hCG、E_2和Hepes的M199培养24—26小时,再以用IonophoreA23187诱导获能的新鲜精子进行授     

兔输卵管上皮细胞解除大鼠早期胚胎发育阻滞的研究

本研究利用兔输卵管上皮细胞,与异种动物大鼠的受精卵共培养,结果大量出现突破２细胞发育阻滞的现象。体外受精卵和体内受精卵的２细胞发育阻滞突破率分６２％和７３％;利用ＲＯＥＣ条件培养液培养大鼠的体外受精卵,２细胞发育阻滞的突破率达６８％,且能顺利发育至桑椹胚和囊胚。将ＲＯＥＣ直接培养在含＾３５Ｓ－甲硫氨酸的ＣＺＢ培养液中,经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影,发现在该条件培液中出现了分子量分别为１     

牛体外受精卵在两种共同培养系统中发育的研究

为了使牛体外受精卵能通过体外早期发育阻滞期,我们建立了卵丘细胞单层(A)和输卵管上皮单层(B)两种共同培养系统。A1共同培养实验是在本实验室进行的,A2和B共同培养实验均在日本岗山大学农学部动物繁殖学研究室进行,牛输卵管组织的分离使用0.76％EDTA—PBS溶液,共同培养系统均使用含10％小牛血清的TCM—199(Earle's salts)作为培养液。培养的卵泡卵母细胞体外成熟率为100％,体外受精率为99—100％。在A1共同培养实验中,越过阻滞期发育到16—细胞以上的胚胎占卵裂胚的35.7％,与A2共同培养实验中越过阻滞期的发育率(40.1％)无显著差异(P<0.05)。A1和A2共同培养实验,在卵裂基础上得到的桑椹胚和囊胚发育率分别为23.7％和27.9％。每百枚培养的卵母细胞,在A1共同培养实验中可获得桑椹胚和囊胚15.1枚,在A2共同培养实验中可获桑椹胚和囊胚的20.5枚。B共同培养实验中桑椹胚和囊胚发育率为54.1％,显著高于A1或A2共同培养实验的相应发育率(P<0.001),使用B共同培养系统每百枚培养的卵母细胞可以获得37枚桑椹胚和囊胚。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

IVF-20培养液用于大鼠体外受精的实验研究

目的探讨人用体外受精液用于实验大鼠体外受精的可行性,为实验大鼠的胚胎保种提供参考。方法选用人体外受精IVF-20培养液作为大鼠精子获能和受精培养液,对SD、Wistar、GK、F344等四种不同品系的实验大鼠进行体外受精;用mR1ECM培养液对体外受精所得胚胎进行体外培养实验。同时,将所得2-细胞胚胎移植给经假孕处理的受体鼠。结果四个品系大鼠体外受精后的卵裂率分别可达83.2%、72.6%、87.8%和71.6%。体外受精卵裂胚能够在体外进一步发育,SD大鼠囊胚发育率为16.7%,与体内受精胚胎在体外培养的囊胚发育率(24.5%)差异不显著。80枚2-细胞胚胎移植给2只受体鼠后均妊娠成功,产下正常仔鼠10只,产仔率12.5%。结论用于人体外受精的IVF-20培养液同样适合于实验大鼠精子的体外获能和受精,可以在多种品系获得较高的卵裂率,所得卵裂胚能够在体外发育到囊胚,并且所得卵裂胚在移植给受体鼠后能够产下正常仔鼠。     

绵羊体外受精卵的体外发育及冷冻保存研究

将体外成熟、体外受精的绵羊卵子,在体外培养至桑椹胚—襄胚期并进行冷冻保存,观察了培养卵的体外发育和冷冻保存效果。从采自屠宰场的绵羊卵巢中抽取卵母细胞,用含有10％FCS(或NSS)、HCG、E_2和Hepes的M199培养24—26小时,再以经Ionophore A23187诱导获能的新鲜精子进行授精。授精后6—8小时移入发育用培养基内进行培养,发育用培养基为含有10％FCS(或NSS)、丙酮酸钠、Hepes的M 199。授精72小时后,FCS组和NSS组的卵裂率分别为36.9％和45.2％,后者显著高于前者。继续培养7—10天后,桑椹胚～囊胚的发育率分别为11.6％和23.4％,两者间差异极显著。将桑椹胚和囊胚冷冻保存于PBS+20％FCS+10％乙二醇冷冻液内,解冻后的胚胎形态正常率分别为82.0％和71.9％。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异（P<0.01）,平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

“试管家畜”生产技术及其应用前景

本文简要地介绍了什么是“试管家畜”以及生产“试管家畜”的主要技术过程:卵子的回收及卵子的成熟培养;精子的采集及体外获能处理;卵子和精子的体外受精;受精卵的体外发育;“试管胚”的移植等,并对这项生产技术的科学价值和应用前景作了概述和展望。     

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。     

家养双峰驼卵巢卵母细胞的体外受精与早期发生的初步研究

本研究将采自屠宰母驼的卵卵母细胞在含有促性腺激素和胎牛血清的Ｍ１９９培养液中培养成熟后,将公驼附睾精子于含有咖啡因和牛血清蛋白的ＢＯ培养液中进行获能培养２小时,然后将成熟卵母细胞移入经过培养的精子悬液中,６－７小时以后将卵子移入含有胎牛血清及及丙酮酸钠的Ｍ１９９中继续培养。结果表明,经过成熟培养后有４６．７％（１４／３０）的卵母细胞发育为成熟卵子,并获得了４３．２％（１６／３７）的体外受精率,实验     

ERα特异性抑制剂MPP降低小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E水平

目的观察雌激素受体(ERa)特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(methyl-piperidino-pyrazole,MPP)对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E表达水平的影响,阐明ERa对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用,为进一步探讨ERa在小鼠植入前胚合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。方法收集昆明雌性小鼠与雄性小鼠交配所得的受精卵,分别置于无MPP的培养液和含20mmol/L MPP的培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色技术检测细胞内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平。结果免疫荧光染色结果显示,含20mmol/L MPP培养液培养的受精卵其体外发育2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E免疫反应性明显降低。结论 ERa可通过调控小鼠2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平,影响细胞从G1期到S期的过渡。     

乙醇对着床前小鼠胚胎体外发育的影响

用含不同浓度乙醇的Whitten氏培养液对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养,研究了乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含0、0．1％、0．5％、1．0％、1．5％、2．0％、3．0％、5．0％和10．0％乙醇的Whitten氏培养液对2细胞胚胎进行培养,发现小鼠2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限在1．5％左右。然后又用含1％和3％乙醇的Whitten氏培养液分别对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果发现：含1％乙醇的培养液对于8细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用,而在2细胞和4细胞胚胎中则影响不明显。3％乙醇则对各期胚胎均有不同程度的抑制作用,但随着胚胎发育其对乙醇的耐受力逐渐增强。     

小鼠嵌合体制作技术的研究

本研究采用人工聚合技术,将小鼠不同品系和同品系之间的8细胞胚聚合为一体,分别用PBS FCS、BWW和BMOC-Ⅲ培养20—24小时后观察了发育率。其结果在昆明白←→C57中分别有88.1％(59/67)、95.0％(115/121)和94.8％(73/77),在昆明白←→昆明白中分别有93.3％(28/30)、87.7％(121/138)和86.7％(52/60)的嵌合胚发育为桑椹胚或胚泡,各处理组之间无显著差异。将141枚嵌合胚分别移植给12只受体,结果有7只小鼠妊娠共产仔25只。在昆明白←→C57的17只嵌合体小鼠中毛色为黑、白和杂色的各有3、4和10只。     

影响山羊体外受精的因素

以屠宰山羊卵母细胞为材料研究了公羊个体、附睾不同部位精子、成熟培养和受精时卵丘存在与否、卵丘扩展程度及卵龄对山羊体外受精的影响。结果表明 :1)不同公羊精液在受精、卵裂和桑椹 /囊胚率上都有显著差异 ;2 )附睾尾精子和鲜精的受精、卵裂和桑椹 /囊胚率无显著差异 ,但显著高于附睾体和附睾头精子 ;3)成熟培养 2 4和 2 7h卵母细胞的的桑椹胚 /囊胚率显著高于培养 2 1和 30h卵母细胞 ;4 )卵丘扩展 3和 4级卵母细胞受精和桑椹胚 /囊胚率显著高于扩展 0和 1级卵母细胞 ;5 )成熟培养前机械去卵丘严重影响卵母细胞体外受精和桑椹胚 /囊胚率 ;6 )受精前完全去掉卵丘显著影响桑椹胚 /囊胚率     

昆明小鼠精子冷冻的研究(简报)

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受体,生长发育并产出幼仔。胚胎体外培养获得足够的晚桑葚胚和早期囊胚是胚胎干细胞建立与制备嵌合体小鼠的成功关键,暂时不用的胚胎应仍能耐受冷冻保存,待复苏移植,建立新的繁殖群。但小鼠精子冷冻研究在我国开展的十分有限,缺乏相关资料数据。本实验对不同周龄SPF级昆明(KM)小鼠进行精子冷冻及冻融精子IVF,并将IVF获得的2-细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植,应用冻融小鼠精子进行胚胎工程实践。     

昆明白小鼠1细胞胚胎体外培养系统的研究

研究发现在有或者没有磷酸盐的条件下,葡萄糖均抑制昆明白小鼠ｌ－４细胞期胚胎的体外发 育。在不含葡萄糖和磷酸盐的ＨＥＣＭ－ｌ中,桑椹率为４０．０５％（７４／１６８）,而对照Ｇ－ＨＥＣＭ－１仅为 ８．１４％（７／８６）;不含葡萄糖含有磷酸盐的ＣＺＢ中,桑椹率为６７．１１％（９３／１５２）,而对照ＴＡＬＰ仅 ６· ６７％（６／９０）。用不含葡萄糖而含有１． ０ｍｍｏ１／Ｌ谷氨酸肢和０． １１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的ＣＺＢ液,与兔输 卵管上皮单层培养细胞（ＲＯＥＣ）协同培养小鼠１细胞胚,７３．３３％（１１０／１５０）胚胎发育至桑椹胚, 但没有观察到囊胚形成、用上述ＣＺＨＲＯＥＣ系统培养小鼠１细胞胚４８小时（３－４细胞）,再移入 ＴＣＭ１９９＋１０％ＦＣＳ＋ＲＯＥＣ系统,有７６．７４％（６７／８６）胚胎发育至桑椹胚,９６／小时后,４０．７０％ （３５／８６）发育至囊胚。     

胞浆内精子注射技术生产小鼠

以piezo操作系统为技术支撑 ,在掌握小鼠卵母细胞胞浆内精子注射技术 (ICSI)的基础上 ,进行了ICSI技术生产试管小鼠的尝试。来自成年昆明 (KM)小鼠附睾尾的新鲜精子 ,剪切去尾后 ,直接将精子头注射到B6D2F1小鼠卵母细胞质中 ,注射后 1h ,83.3%的卵母细胞存活。6h时 ,84.0 %的成活卵子成功受精 ,形成原核 ,排出PB2 体外培养的ICSI胚胎 ,卵裂率 (98%vs 94.7% )和 4-细胞期胚胎比率 (89.5%vs 92.1% )均与培养的体内受精卵没有差异 (P >0.05 ) ;但是 ,桑椹胚(63.8%vs84.2% )和囊胚发育率 (25.7%vs68.4% )极显著地 (P <0.01)低于对照组。120枚原核期胚胎移植给 7只假孕受体后 ,4只受孕小鼠共产出 28只ICSI小鼠 (23.3% )。健康成年的 25只ICSI小鼠都没有明显的生理和行为异常。随机选择其中的 20只小鼠 ,分别进行ICSI小鼠间、ICSI与KM小鼠间共 12组的交配 ,结果所有雌鼠妊娠产仔。在成功建立小鼠ICSI技术的基础上,成功获得了我国的首例ICSI小鼠,并且证明这些ICSI小鼠都具有正常的繁殖后代的能力。     

FGF10对小鼠植入前胚体外发育及2-细胞胚内G蛋白偶联受体30表达的影响

目的 观察成纤维细胞生长因子10(FGF10)对小鼠受精卵体外发育和2-细胞胚内G蛋白偶联受体30(GPR30)水平的影响,为进一步探讨FGF10在小鼠植入前胚体外发育中的作用提供依据。方法 以M16培养液为对照组,M16中分别添加不同浓度的FGF10为实验组,收集昆明(KM)雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的受精卵,分别观察各组受精卵体外发育情况。收集KM小鼠受精卵,分别置于M16和含不同浓度FGF10的M16培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色结合激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内GPR30水平。结果 添加FGF10实验组发育到4-细胞胚、桑葚胚和囊胚的比率明显高于对照组,其中以添加浓度为10ng/ml的FGF10实验组的效果最明显。免疫荧光染色结果显示,10ng/ml的FGF10实验组体外发育2-细胞胚内GPR30免疫荧光染色强度明显高于对照组。结论 FGF10可促进KM小鼠植入前胚的体外发育,其作用可能与上调2-细胞胚内GPR30有关。