钙通道蛋白Orai1在骨肉瘤细胞转移中的作用研究

目的:骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤,恶性程度高,往往在早期就会发生远隔器官的转移,从而导致骨肉瘤的预后非常差。Orai1是一类定位于细胞膜,介导钙离子内流的受体依赖性钙通道蛋白。大量研究发现钙通道蛋白Orai1过表达于多种肿瘤细胞,并对维持肿瘤细胞粘附、侵袭、迁移等恶性表型有非常重要的作用。然而,钙通道蛋白Orai1是否参与了骨肉瘤的转移过程,目前未见相关报道。本研究的目的是探究钙通道蛋白Orai1是否在骨肉瘤转移过程中的发挥作用。方法:利用合成的靶向Orai1的小干扰RNA(Orai1 si RNA)片段,转染至人骨肉瘤细胞系Saos-2细胞。在Saos-2细胞中抑制Orai1的表达。采用细胞黏附实验、细胞划痕实验和细胞Transwell实验检测骨肉瘤细胞的黏附、迁移及侵袭等肿瘤细胞转移能力;Western-blot实验检测Saos-2细胞的中黏着斑激酶(FAK)和桩蛋白(Paxillin)的表达水平和磷酸化水平。结果:靶向Orai1 si RNA瞬时转染至骨肉瘤细胞系Saos-2细胞后,Saos-2细胞中Orai1蛋白表达水平和m RNA转录水平均显著下降。并且,在Saos-2细胞中抑制Orai1表达后,Saos-2细胞的黏附能力、迁移能力、及侵袭能力均显著下降。进一步研究发现,在Saos-2细胞中抑制Orai1表达后,Saos-2细胞的FAK和Paxillin磷酸化水平明显下降。结论:Orai1可以促进骨肉瘤细胞的黏附、迁移和侵袭,增加黏着斑的形成,从而促进骨肉瘤的转移。因此,深入研究钙通道蛋白Orai1调控骨肉瘤转移的分子机制,可为骨肉瘤转移的治疗提供新的新方向和新策略。     

miRNA-132抑制人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力

目的观察miRNA-132在不同骨肉瘤细胞系中的表达及对骨肉瘤细胞生物学行为的影响,探讨miRNA-132在人骨肉瘤发生发展中的作用。方法通过荧光定量PCR技术检测不同骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中miRNA-132的表达情况,使用pRFP-miRNA-132-down质粒转染U2OS细胞、pRFP-miRNA-132-up质粒转染143B细胞,使用EdU检测肿瘤细胞增殖状态,Transwell小室检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力。结果在3种骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、143B中,miRNA-132的表达依次下降(U2OSMG63143B);降低miRNA-132在U2OS细胞中的表达促进细胞的增殖和侵袭能力,增加miRNA-132在143B细胞中的表达抑制细胞的增殖和侵袭能力。结论 miRNA-132可能通过抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭调节骨肉瘤的发生发展。     

抑制Notch信号通路联合沉默Id1对骨肉瘤恶性生物学行为及成骨分化的影响

该研究探讨了抑制Notch信号通路联合沉默Id1对人骨肉瘤细胞MG63的恶性生物学行为及成骨分化的影响。采用Notch信号通路抑制剂DAPT、沉默Id1重组腺病毒分别或联合处理MG63细胞,采用Western blot检测分组处理MG63细胞后Notch1、Jagged1、Id1蛋白的表达;CCK8检测分组处理后MG63增殖能力;流式细胞术检测分组处理后MG63细胞凋亡水平;划痕实验和Transwell检测分组处理后MG63细胞迁移和侵袭能力;碱性磷酸酶、茜素红染色分别检测分组处理后MG63细胞早期、晚期成骨分化能力。结果表明,DAPT处理MG63细胞后,Notch1、Jagged1蛋白表达下调(P0.05),可有效抑制MG63细胞中Notch信号通路活性;抑制MG63细胞中Notch信号通路后Id1蛋白水平表达下降,抑制MG63细胞中Notch信号通路联合沉默Id1后Id1蛋白表达水平最低(P0.05);抑制MG63细胞中Notch信号通路后细胞增殖、迁移、侵袭能力下降,凋亡水平增加和早期成骨分化能力减弱(P0.05);抑制MG63细胞中Notch信号通路联合沉默Id1后细胞增殖、迁移、侵袭能力进一步减弱,凋亡水平最高,早期、晚期成骨分化能力增强(P0.05)。综上所述,抑制Notch信号通路可减弱MG63细胞恶性;抑制Notch信号通路联合沉默Id1后可进一步减弱MG63细胞恶性,促进其成骨分化。     

STIM1调控细胞运动促进骨肉瘤转移的研究

目的:明确STIM1是否参与调控细胞运动促进骨肉瘤的转移。方法:应用靶向STIM1的si RNA沉默MG-63骨肉瘤细胞中STIM1的表达,然后用侵袭实验、迁移实验以及黏附实验检测骨肉瘤细胞侵袭、迁移与黏附能力的变化,采用Western Blot检测细胞FAK和paxillin的表达及Rac1和RhoA信号通路的活性。结果:转染靶向STIM1的si RNA后,MG-63骨肉瘤细胞中STIM1的蛋白表达和m RNA表达均明显降低(P0.05),细胞的侵袭、迁移与黏附能力均显著下降(P0.05),细胞伪足与细胞骨架的重要组分FAK和paxillin的表达及调控细胞运动的Rac1和RhoA信号通路活性均显著降低(P0.05)。结论:STIM1可能通过激活RhoA和Rac1的信号通路,增加FAK和paxillin的表达,从而调控骨肉瘤细胞运动,促进骨肉瘤转移。     

Ad-ERα-36-Fc-GFP的制备及鉴定北大核心CSCD

ERα-36是雌激素受体α新亚型,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药,可作为治疗靶点,但目前仅有小分子靶向药物研发。利用重组腺病毒携带诱饵受体,可进行靶向ERα-36的基因治疗探索。首先通过基因工程技术,构建可表达由Igκ信号肽引导分泌的重组融合蛋白ERα-36-Fc的穿梭质粒pDC316-Igκ-ERα-36-Fc-GFP;利用AdMax;腺病毒包装系统进行Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的包装、鉴定及扩增;感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231并进行表达及功能验证。结果表明成功制备Ad-ERα-36-Fc-GFP重组腺病毒,可高效感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,表达并分泌ERα-36-Fc重组蛋白,显著抑制EGFR/ERK信号通路。Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的制备为进一步开展靶向ERα-36的肿瘤基因治疗研究奠定基础。     

EGFRvⅢ胞外区基因重组腺病毒的构建及单域抗体的制备北大核心CSCD

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒,并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库,筛选和制备EGFRvⅢ胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增EGFRvⅢ胞外区基因,并连接pAdTrack-CMV质粒载体,转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183感受态细胞,获得同源重组质粒转染HEK293A细胞,得到表达EGFRvⅢ胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼,构建EGFRvⅢ胞外区特异性噬菌体单域抗体库,并以EGFRvⅢ蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×109;经过3轮富集和筛选,通过噬菌体ELISA筛选出31个与EGFRvⅢ胞外区蛋白结合的阳性克隆,并对OD450值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA鉴定,重组单域抗体E14可与EGFRvⅢ胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性,为今后以EGFRvⅢ为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。     

过表达外源性CCN1对人骨肉瘤细胞系143B生长和迁移的影响

采用AdEasy系统构建带有标记基因GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1,并感染人骨肉瘤细胞,观察外源性CCN1对肿瘤细胞生长和迁移的影响.PCR扩增FC编码序列标记的人CCN1克隆到pAdTrack-TO4中获得重组穿梭载体pAdTrack-CCN1. PmeⅠ线性化该质粒并电转到有腺病毒骨架质粒的BJ/AdEasy 1菌中,同源重组获得腺病毒质粒pAd-CCN1,PacⅠ线性化并转染293细胞,包装制备AdCCN1.卡那霉素抗性筛选、XbaⅠ与KpnⅠ酶切鉴定,荧光显微镜和Western印迹检测标记基因GFP和FC表达,鉴定获得的复制缺陷型重组腺病毒AdCCN1.AdCCN1与AdGFP分别感染人骨肉瘤细胞143B,通过MTT实验、胶原集落形成实验、划痕愈合和室移动实验,观察CCN1对143B增殖和迁移的影响.酶切鉴定表明,带有FC标记的CCN1被成功克隆到穿梭载体pAdTrack中.卡那霉素抗性筛选并酶切鉴定,获得重组腺病毒质粒pAd-CCN1.Western 印迹和荧光显微镜观察,确定与CCN1共表达的FC和GFP表达.AdCCN1感染骨肉瘤细胞, 与对照比较细胞数量增多,集落形成增加,细胞划痕逐渐愈合,迁移至膜上的细胞数量明显增加.应用AdEasy系统高效快速构建了带有标记GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1,为监控腺病毒转基因的效果提供了便捷的工具.AdCCN1感染骨肉瘤细胞后可促进细胞增殖和迁移,提示CCN1在肿瘤发生和转移中可能起到重要作用.     

P37腺病毒表达载体的构建及对乳癌细胞的促迁移作用

胃癌组织中存在着较高的猪鼻支原体感染率,而P37是猪鼻支原体的主要免疫原.以往研究表明,P37能抑制肿瘤细胞的黏附,促进肿瘤细胞浸润和转移.为了更好地研究P37在肿瘤发生和转移中的功能,通过基因克隆的方法,利用Ad-easy体系,在细菌BJ5183中同源重组后,转染293细胞,成功包装出重组P37腺病毒.它能有效感染乳腺癌细胞BICR.通过RT-PCR和蛋白质印迹检测表明,感染重组P37腺病毒后的BICR细胞能大量表达并分泌P37蛋白.运用该腺病毒体系进行细胞迁移实验表明,P37能显著增强BICR细胞的体外迁移能力.     

Calpain2对肝癌细胞浸润和转移能力的影响

目的：肝细胞癌（HCC）是一类常见的恶性肿瘤,主要表现为进展迅速、易复发及预后不良。侵袭转移作为肝癌的最主要的恶性表型,是造成较高致死率的主要原因。Calpain是钙激活中性蛋白酶,广泛参与了细胞多种生命过程。其中Calpainl和Calpain2是Calpain家族主要成员,对于维持肿瘤细胞恶性表型有重要作用。本研究通过RNA干涉技术下调人肝癌Huh7细胞中Calpain2基因的表达,检测下调Calpain2对人肝癌Huh7细胞黏附,侵袭和迁移能力的影响,明确Calpain2在人肝癌细胞浸润和转移过程中的作用。方法：合成Calpain2的RNAi片段,瞬时转染人肝癌细胞Huh7,降低Hull7细胞中Calpain2的表达,运用细胞黏附实验,细胞侵袭实验及划痕愈合实验检测干涉Calpain2对肝癌细胞的黏附,侵袭和迁移能力的影响。结果：合成Calpain2的RNAi片段。瞬时转染人肝癌细胞Huh73,36小时后,细胞中Calpain2的蛋白水平明显下降,干涉Calpain2后人肝癌细胞Huh7的黏附率,侵袭率及划痕修复率的显著下降。结论：以上实验结果表明Calpain2能够促进肝癌细胞黏附,侵袭及划痕修复能力,Calpain2能够促进肝癌细胞的浸润和转移的作用,是肝癌发生发展过程中的肿瘤促进因子。因此,Calpain2可以作为抑制肝癌侵袭和转移的潜在靶点,靶向Call＇ain2的药物可能成为治疗肝癌侵袭转移的新方法。     

白藜芦醇抑制上皮肿瘤细胞侵袭和迁移的机制

白藜芦醇是一种多酚类的植物抗毒素,具有多种生物学活性,其中,抗肿瘤作用受到人们越来越多的关注。大量实验表明,白藜芦醇具有靶向抑制癌细胞侵袭和迁移的能力。EMT过程使上皮细胞获得间充质表型,从而促进癌细胞的侵袭和迁移。Micro RNAs可靶向EMT的转录因子以及上皮和间充质标志物来调节EMT过程。MMP-2和MMP-9是细胞外基质的两个重要成分,均参与肿瘤细胞的转移。白藜芦醇通过影响EMT过程、调控micro RNAs家族的表达以及抑制MMPs的蛋白表达和酶活性来影响上皮肿瘤细胞的侵袭和迁移。现对白藜芦醇抑制上皮肿瘤细胞侵袭、迁移的机制进行综述。     

miR-155靶向SOCS1对骨肉瘤Saos2细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨microRNA-155(miR-155)对骨肉瘤Saos2细胞增殖、侵袭和迁移的影响以及其作用机制。方法:利用实时荧光定量(qRT-PCR)实验检测miR-155在正常成骨细胞与骨肉瘤Saos2细胞中的表达水平,以及miR-155-mimic、miR-155-inhibitor的转染效率。采用CCK-8实验检测细胞的增殖能力,Transwell实验和划痕实验分别检测Saos2细胞的侵袭和迁移能力,Western blot检测细胞内的STAT3磷酸化水平以及SOCS1表达水平,双荧光素酶报告基因实验进行靶基因验证。结果:miR-155在骨肉瘤Saos2细胞中表达明显高于正常成骨细胞(P0.001)。在分别转染miR-155-mimic和miR-155-inhibitor后,Saos2细胞内miR-155表达水平明显上调和下降(P0.001)。过表达miR-155可促进Saos2细胞增殖、侵袭和迁移,降低SOCS1的蛋白水平,上调STAT3的磷酸化水平,差异均具有统计学意义。相反,降低miR-155水平可抑制Saos2细胞的增殖、侵袭和迁移能力,差异均具有统计学意义。结论:骨肉瘤Saos2细胞中高表达的miR-155可以通过抑制SOCS1表达来激活STAT3信号通路进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移,因此,靶向抑制miR-155表达可以作为潜在治疗骨肉瘤的途径。     

DLX1过表达对骨肉瘤细胞MG63迁移、侵袭、凋亡和增殖的影响

前期经基因芯片筛选发现,同源盒基因1(distal-less homeobox 1,DLX1)低表达是导致骨肉瘤形成的关键基因。该研究在此基础上,拟通过过表达DLX1探讨其对骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭等生物学特征的影响,并初步揭示其作用途径。采用含DLX1基因的重组腺病毒Ad DLX1(adenovirus distal-less homeobox 1)和空载腺病毒Ad RFP(adenovirus red fl uorescence protein)分别感染人骨肉瘤细胞MG63,观察细胞荧光表达情况,并用RT-PCR和Western blot验证DLX1表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;DAPI染色和流式细胞术检测细胞凋亡水平;CCK-8检测细胞增殖能力;RT-PCR和Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。结果显示,与对照组(Ad RFP感染组)相比,Ad DLX1能显著增加MG63细胞中DLX1的表达,并导致细胞迁移和侵袭能力下降,但细胞增殖和凋亡情况无明显改变。DLX1过表达还可以上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。该研究表明,DLX1可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞MG63的迁移和侵袭。     

lncRNA CBR3-AS1通过调控miR-145-5p影响胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

为探讨lncRNA CBR3-AS1靶向miR-145-5p对胃癌细胞HGC-27恶性生物学行为的影响,该研究先用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测30例胃癌患者的癌组织及癌旁组织中CBR3-AS1和miR-145-5p的表达水平。然后,将CBR3-AS1干扰表达载体质粒、miR-145-5p模拟物、miR-145-5p抑制剂与CBR3-AS1干扰表达载体质粒转染至胃癌细胞HGC-27;用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡流程;Transwell法检测迁移和侵袭的细胞数;双荧光素酶报告实验检测CBR3-AS1和miR-145-5p的靶向关系。实验结果显示,胃癌组织中CBR3-AS1表达水平高于癌旁组织,而miR-145-5p表达水平低于癌旁组织(P0.05)。过表达miR-145-5p或抑制lncRNA CBR3-AS1表达可降低HGC-27细胞活性,减少迁移侵袭细胞数,而提高细胞凋亡率(P0.05)。lncRNA CBR3-AS1靶向调控miR-145-5p;下调miR-145-5p逆转了抑制lncRNA CBR3-AS1表达对HGC-27细胞的作用。因此,抑制lncRNA CBR3-AS1表达可能通过上调miR-145-5p抑制HGC-27细胞的迁移侵袭、增殖,促进细胞凋亡。     

miR-19a-3p在前列腺癌细胞侵袭和迁移中的作用

miR-19a-3p通过多种机制调节癌细胞的增殖和转移,然而,miR-19a-3p在前列腺癌转移中的生物学作用和机制尚不清楚。本研究旨在考察mir-19a-3p在前列腺癌中的表达情况,及其对细胞侵袭和迁移的影响。本研究发现,miR-19a-3p在骨转移性前列腺癌组织和前列腺癌细胞中明显下调。上调miR-19a-3p可显著抑制前列腺癌细胞的侵袭和迁移。然而,下调miR-19a-3p则会逆转上述变化。此外,本研究还发现miR-19a-3p通过靶向TGF-β信号传导的下游效应物SMAD2来抑制前列腺癌细胞中TGF-β信号传导的活性,从而抑制前列腺癌细胞的侵袭和迁移。因此,本研究表明mir-19a-3p与前列腺癌的发生发展密切相关,mir-19a-3p有望成为前列腺癌的新治疗靶点及生物标志物。     

EGF受体Ⅲ型突变体在肿瘤治疗中的研究进展

EGFRⅢ型变异体(或EGFRvⅢ)是一种新型的肿瘤特异性靶点。EGFRvⅢ是正常分子经过遗传学重排成为肿瘤特异性靶点的最好例证。由于仅在肿瘤细胞中发现EGFRvⅢ,可以应用它设计靶向性药物选择性治疗肿瘤,而不影响正常细胞,避免传统治疗中所见的副作用。以表达EGFRvⅢ的细胞为靶点的治疗方式有三种:1)作为毒性抗体或修饰病毒的直接靶点,2)利用EGFRvⅢmRNA的特异性核酶或EGFRvⅢ及其下游信号传导分子的特异性抑制剂进行治疗,3)利用EGFRvⅢ触发免疫反应。概括介绍了肿瘤特异性标记物EGFRvⅢ在肿瘤治疗中的研究进展。     

miR-335对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的:通过研究miR-335对骨肉瘤细胞系SOSP-9607增殖和迁移的影响,探讨miR-335在骨肉瘤细胞生物学行为中的作用。方法:体外培养SOSP-9607细胞并将其分三组,分别为实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组转染miR-335模拟物(has-miR-335 mimics),阴性对照组转染阴性对照序列(negative control,NC),空白对照组细胞不行任何转染。采用噻唑蓝(MTT)比色实验法检测和比较细胞处理24、48、72和96 h的增殖情况,采用Transwell实验检测和比较各组细胞的迁移情况。结果:MTT结果显示,实验组细胞48、72和96 h增殖率较阴性对照组明显降低(P0.01),而阴性对照组及空白对照组细胞增殖率比较未见明显差异(P0.05)。在Transwell迁移和侵袭实验中,与阴性对照组比较,实验组细胞的侵袭及迁移能力也明显降低(P0.05),而两对照组细胞迁移及侵袭能力也无明显差异(P0.05)。结论:miR-335可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖及迁移,有望成为骨肉瘤治疗的新靶点,值得深入研究。     

SIK1作为miR-93新的靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

该文探讨了SIK1作为miR-93新的靶基因对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。采用重组质粒pcDNA3.1-SIK1上调前列腺癌细胞中SIK1的表达后,利用CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖;利用细胞划痕和Transwell实验检测细胞侵袭和迁移;利用Western blot检测E-cadherin和Vimentin的蛋白表达。采用生物信息学方法预测靶向SIK1 mRNA的3’UTR的miRNAs并进行筛选;双荧光素酶报告实验和Western blot验证miR-93靶向调控SIK1。结果显示,上调SIK1的表达能抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并增加E-cadherin和减少Vimentin蛋白表达;miR-93能够靶向负调控SIK1。总之,SIK1可作为miR-93一个新的靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。     

Rho GTPases与肿瘤

Rho GTPases参与调控细胞的多种关键生物学行为,特别是细胞的生长、细胞骨架的形成、转录调节等生物学过程. 在肿瘤的发生发展中Rho GTPases也扮演了重要的角色．本文将回顾Rho GTPases的调控（包括经典及非经典调控方式）及其关键成员（RhoA、Cdc42及Rac1）与临床肿瘤的研究进展,特别是它们参与调控肿瘤的增殖、迁移、侵袭、凋亡等恶性生物学行为,从而为研发靶向Rho GTPases的小分子/基因药物了奠定基础．     

共表达IL-15和CCL19的EGFRvⅢ CAR-T细胞的构建和功能探究

本研究分析了共表达白细胞介素-15 (interleukin-15, IL-15)和趋化因子配体19 (C-C chemokine ligand 19, CCL19)的EGFRvⅢ CAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果，旨在优化CAR-T细胞多项功能，提高靶向EGFRvⅢ 的CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的治疗效果。通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒，转染293T细胞获得慢病毒并感染T细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T)。利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢ CAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等。结果表明，与EGFRvⅢ CAR-T细胞相比，EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15和CCL19，具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05)，而体外特异性杀伤能力无显著差异。因此，靶向EGFRvⅢ且同时分泌IL-15和CCL19的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果，为临床试验提供一定的参考依据。