接种马铃薯软腐病菌引起的烟草叶片爆发

用马铃薯软腐病菌处理烟草后,以化学法测定了叶片中O-2含量,发现在接种后1～14 h内只出现一次O-2爆发,不同于以往植物悬浮细胞研究中出现的两次爆发结果.接种软腐病菌后2 h和6 h烟草叶片O-2的电子自旋共振波谱图(electron spin resonance,ESR)显示了同样的一次O-2爆发结果.接种后烟草叶片的线粒体和叶绿体O-2爆发与叶片的同步,显示此两种细胞器参与烟草叶片在软腐病菌作用下的O-2发生.无光照叶绿体O-2的ESR谱线不出现,表明叶绿体O-2可能来源于光合电子传递链.马铃薯软腐病菌作用下烟草叶片的O-2爆发是多位点的.     

小麦与叶锈菌互作过程中的H2O2与HR

以小麦品种洛夫林10为材料,与叶锈菌生理小种165和260分别组成亲和组合和不亲和组合.以荧光探针DCFHDA标记H2O2的变化,并借助荧光显微镜原位地直观显现了叶锈菌侵染过程中小麦叶片中H2O2的动态变化.结果表明,亲和组合中H2O2爆发表现为单峰曲线,峰值出现在接种后12h;不亲和组合中表现为双峰曲线.峰值分别出现在接种后12h和20h,第二个峰比第一个高约一倍,且不亲和组合中H2O2爆发的强度远远大于亲和组合.另外,通过药理学试验,采用活体注射法对小麦叶片在接种叶锈菌小种260之前分别预注射抗氧化药物AsA、DTT以及NADPH氧化酶抑制剂DPI和咪唑.观察这些药物对不亲和组合中寄主叶片产生的H2O2和HR的影响.结果表明,抗氧化药物和NADPH氧化酶抑制剂均使寄主叶片中H2O2爆发的强度降低,表现在两个H2O2峰均受到抑制,其中第二个峰受抑制的程度更明显,同时寄主细胞发生HR的面积减小.     

转GhB301基因烟草的防御酶活性及抗病相关基因表达分析

为了明确棉花ERF-B3亚族转录因子基因GhB301在烟草异位表达后(抗枯萎病中)的功能,该研究以过表达GhB301基因烟草和野生型烟草为材料,采用枯萎病菌孢子悬浮液接菌方法,分析病原菌侵染前后防御酶活性变化以及防卫相关基因的表达变化与抗病性的关系。结果显示:(1)棉花枯萎病菌处理15d后,2个转基因株系烟草叶片黄化程度与野生型相比较轻。(2)棉花枯萎病菌处理后,过表达GhB301转基因烟草和野生型烟草叶片过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的活性较未接菌对照显著提高,并且酶活峰值出现均早于野生型材料;转基因材料叶片的POD、PAL、PPO活性均在处理3d后达到峰值,而野生型材料叶片的POD、PAL活性在处理5d后才达到峰值。(3)接种棉花枯萎病菌后活性氧相关基因、乙烯(ET)/茉莉酸(JA)途径相关基因、病程相关基因的表达量在转基因株系OE1和OE2中均受到明显影响。研究推测,GhB301在烟草中的异位表达激活了防卫相关基因的表达,提高了防御酶的活性,从而增强了烟草对枯萎病菌的抗性。     

不同磷营养水平对烟草叶片光合作用和光呼吸的影响

随着磷营养水平的提高,烟草叶片的CO_2补偿点下降、光合速率上升。光呼吸在缺磷时最高。用光呼吸抑制剂处理烟草叶片后,光合的最适磷浓度提高。当CO_2浓度为560μl/L时,缺磷的烟草叶片在从21％O_2转入2％O_2时出现光合振荡,表明光呼吸与磷营养有密切关系。光呼吸在形成乙醇酸时所释放的磷,有回补叶绿体进行光合作用所需的磷的作用。     

抗氰交替途径对寄主植物感病性的调节

马铃薯块茎切片－ 软腐病菌亲和互作过程中, 不同强度的亲和互作中活性氧的释放有其不同的特点。在强亲和互作中的２４ 小时内,无明显的活性氧释放。但在弱亲和互作中,互作８ 小时后,即有明显的活性氧的释放,２０ 小时达到高峰,并且这种活性氧的释放提高寄主的抗病性。试验显示马铃薯块茎切片与软腐病菌的亲和互作诱导寄主抗氰交替途径的运行,ＳＨＡＭ 处理降低亲和互作过程中寄主的感病性, 同时ＳＨＡＭ 处理也促进亲和互作中寄主活性氧释放高峰的出现, 表明抗氰交替途径的运行可通过抑制亲和互作中寄主活性氧的产生而促进寄主的感病性。从而证明了一种新的寄主植物抗感病反应机制     

H2O2参与棉疫病菌90 kD蛋白激发子诱导的烟草过敏反应和系统获得抗性

野生型烟草Bel-W3叶片经棉疫病菌90kD蛋白激发子处理后,处理叶及其上位叶在24h内均发生2次氧化迸发产生H2O2,且第二次H2O2进发高峰期同时出现,均出现在第12小时,处理部位细胞死亡高峰期比第二次H2O2迸发高峰期滞后8h。引起过敏反应剂量的激发子诱发反义抑制抗坏血酸过氧化物酶anti-APX烟草的过敏性坏死枯斑比野生型的大而且出现得早;不能诱发野生型烟草HR的剂量可以诱导anti-APX烟草发生HR。经激发子处理后anti-APX烟草对烟草疫霉(Phytophtora nicotianae)和TMV产生的诱导抗性比其野生型高。上述结果表明,H2O2可能是一种重要的信号分子,在棉疫病菌90kD蛋白激发子诱发烟草的HR和SAR中具有重要作用,但可能不是一种可以系统移动的信号分子。     

单细胞光合生物莱茵衣藻光系统Ⅱ产生超氧阴离子自由基的ESR研究

强光辐照下高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)会产生超氧阴离子自由基(O-2),该过程中产生的O-2在高等植物光合作用活性氧自由基代谢中具有重要作用.莱茵衣藻光系统结构与高等植物非常相近.应用新型高特异性自旋捕获.ESR方法及四唑氮蓝还原法,首次在莱茵衣藻的类囊体膜和PSⅡ中检测到O-2的生成,通过与有关菠菜的ESR实验结果对比发现两者的O-2产生分子机制可能极为相似.相比高等植物,单细胞莱茵衣藻具有结构简单、遗传背景清晰与基因组测序工作完备等诸多特点.因而,针对莱茵衣藻的O-2分析可能为深入研究高等植物光合系统中的活性氧代谢机制提供新的契机.     

苜蓿假盘菌侵染苜蓿叶片的细胞学研究

采用微分干涉相差显微镜、扫描和透射电镜技术系统研究了苜蓿假盘菌Pseudopeziza medicaginis在苜蓿叶片的侵染过程及超微结构特征。结果表明,接种4h后,子囊孢子萌发产生芽管：12h后,芽管以直接侵入的方式进入表皮细胞形成侵染菌丝：24h后,表皮细胞中侵染菌丝向相邻表皮细胞扩展,同时侵入到叶肉细胞以胞内生长方式扩展：接种72h后,侵染菌丝在表皮细胞下的叶肉组织中形成初始菌落;第5d后,菌丝扩展至整个叶片组织,大量菌丝聚集形成子座组织,并进一步形成子囊盘与子囊。病菌菌丝在侵入寄主细胞初期,并不穿透寄主质膜与原生质,而是被其所包围。但随着菌丝进一步扩展,叶片组织发生了一系列的病理变化,其中包括叶肉细胞肿胀、细胞质消解、叶绿体等细胞器解体以及寄主细胞坏死塌陷,并最终在叶表面产生典型的褐斑病症状。     

苜蓿假盘菌侵染苜蓿叶片的细胞学研究

采用微分干涉相差显微镜、扫描和透射电镜技术系统研究了苜蓿假盘菌Pseudopeziza medicaginis在苜蓿叶片的侵染过程及超微结构特征。结果表明,接种4h后,子囊孢子萌发产生芽管;12h后,芽管以直接侵入的方式进入表皮细胞形成侵染菌丝;24h后,表皮细胞中侵染菌丝向相邻表皮细胞扩展,同时侵入到叶肉细胞以胞内生长方式扩展;接种72h后,侵染菌丝在表皮细胞下的叶肉组织中形成初始菌落;第5d后,菌丝扩展至整个叶片组织,大量菌丝聚集形成子座组织,并进一步形成子囊盘与子囊。病菌菌丝在侵入寄主细胞初期,并不穿透寄主质膜与原生质,而是被其所包围。但随着菌丝进一步扩展,叶片组织发生了一系列的病理变化,其中包括叶肉细胞肿胀、细胞质消解、叶绿体等细胞器解体以及寄主细胞坏死塌陷,并最终在叶表面产生典型的褐斑病症状。     

烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析

植物类蛋白激酶Abc1家族(activity of bc1complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中起着重要的作用。该研究通过将拟南芥AtOSA1蛋白氨基酸序列与烟草转录组数据进行比对,利用巢式PCR技术克隆得到1个烟草氧化胁迫相关Abc1家族基因NtOSA1,NtOSA1与拟南芥AtOSA1基因具有72.89%的一致性。NtOSA1基因开放阅读框长度为2 283bp,编码760个氨基酸,含有典型的ABC1结构域、一个激酶结构域、叶绿体定位信号肽和两个跨膜结构域。采用实时荧光定量PCR技术,对NtOSA1基因在烟草不同组织以及氧化胁迫、盐胁迫等处理下的表达分析表明:NtOSA1基因的表达具有组织特异性,主要在叶片中表达;NtOSA1基因在H2O2和NaCl处理后表达量上升,均在处理后6h达到最大值,分别为处理前的1.95和2.69倍。亚细胞定位结果表明,NtOSA1蛋白定位在细胞叶绿体上,与预测结果一致。研究表明,NtOSA1基因参与了烟草抗氧化胁迫和盐胁迫的响应。     

钙对烟草叶片热激忍耐和活性氧代谢的影响

热胁迫导致烟草叶片细胞膜系统显著受损,表现为SOD活性降低和MDA含量明显升高,叶片叶绿素含量下降,活性氧增加。10 mmol/L CaCl2溶液处理烟草幼苗后,能有效降低热胁迫下叶片细胞膜透性,维持较高的SOD和CAT等抗氧化酶活性,减缓 O-·2 形成和膜脂过氧化反应。研究结果表明,CaCl2处理提高了烟草叶片膜稳定性和膜保护酶活性,有利于保护细胞膜结构,降低高温对烟草幼苗的伤害。钙离子螯合剂EGTA能在一定程度上降低烟草叶片的抗热性。     

黄瓜花叶病毒衣壳蛋白存在于被其侵染的烟草叶绿体中

用原生质体法制备出高纯度的完整叶绿体经SDS-PAGE电泳,银染后,发现黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的烟草病叶叶绿体蛋白质图谱和健叶叶绿体相比,多出一条染色较弱的迁移率与CMV衣壳蛋白质相同的带,经Western转移,用CMV游离衣壳蛋白亚基抗血清进行斑点酶联(Immunoblot)检测,证明这条带就是CMV衣壳蛋白质。健康叶绿体中加入去掉叶绿体的病叶汁液而制备出的叶绿体中无CMV衣壳蛋白质,说明这不是在叶绿体提纯过程中得到的假象,即衣壳蛋白质存在于被CMV侵染的完整叶片叶绿体中。这个结果否认了以往报道的CMV衣壳蛋白质不存在于烟草叶绿体中的结论。另外还发现,叶绿体中的衣壳蛋白质浓度与叶片症状严重程度呈正相关。     

烟草野火病菌毒素研究进展

烟草野火病是烟草生产上的主要病害之一,在我国云南等主要烟草栽培地区常年发生,危害十分严重。该病由ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳｙｒ加ｇａｅｐＶ．田ｂａｃｔ引起。病菌侵染烟草后,在叶片上产生周围有一很宽黄绿晕圈的圆形褪色斑点［’］。Ｊｏｈｎｓｏｎ和Ｍｌｊｎｖｉｎ首次报道病菌的除细胞滤液接种叶片也能引起野火症状,表明野火病菌产生一种外毒素。二十世纪５０年代,Ｗｏｏｌｌｅｙ和Ｂｒｏｕｎ提出浓缩和分析毒素的方法以后,人们开始对野火病菌毒素进行系统的研究。ｌ＄素的提取毒素的提取是毒素得以详细研究的第一步,但由于…     

小麦与叶锈菌互作过程中细胞程序性死亡的细胞学观察

小麦(Triticum aesetivum)品种洛夫林10和叶锈菌(Puccinia recondita f.sp tritici)小种162、165分别组成不亲和组合与亲和组合。透射电镜观察表明,在小麦与叶锈菌的不亲和组合中,接种后12h,侵染点周围叶肉细胞核变形;接种后24h,核内染色质开始凝聚,并趋于细胞核边缘,同时叶绿体膨胀;接种后48h,核内染色质凝聚加剧,叶绿体开始解体;最终在接种后72h,细胞核、叶绿体完全解体,线粒体开始退化。此外,内质网和液泡共同行使溶酶体功能,吞噬各种细胞器残体及原生质降解组分。以上结果表明:在小麦与叶锈菌不亲和组合的互作过程中,寄主细胞呈现细胞程序性死亡的典型特征。而在亲和组合中,叶肉细胞间隙中可见有大量菌丝蔓延,菌丝与寄主细胞壁接触后分化产生吸器母细胞。菌丝的存在对寄主细胞的超微结构产生一定影响。从接种后24h开始,与菌接触的细胞出现质膜下陷,叶绿体稍显膨胀;在接种后48h、72h,大部分叶绿体膨胀,而其它细胞器无明显变化。     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHE 1基因(potato Phytophthora infestans induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA.序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinl有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83%和81%).Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2～3个拷贝.对其诱导表达模式研究表明:晚疫病病原菌接种36 h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCl浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达.该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关.     

高CO_2浓度对大豆不同叶位叶片叶绿体淀粉粒积累的效应

对高CO_2浓度下生长的大豆(Glycine max(L.)Merr.)不同叶位的叶片进行了电镜观察,揭示出大豆不同叶位叶片的叶绿体对倍增的CO_2浓度反应不一。其显著的超微结构差异特征是:1.叶位居中的叶片叶绿体积累的淀粉粒不仅很大,而且最多,有的叶绿体中的淀粉粒可达20个,几乎充满着叶绿体的基质空间。2.下位叶叶绿体的淀粉粒积累较多,通常为2～5个;3.上位叶叶绿体所含淀粉粒既小又少,虽然有的叶绿体中也积累有3～4个淀粉粒,但大多数叶绿体中所含淀粉粒仅有1～2个。以上结果联系到大豆中位叶的光合作用速率较高及对籽粒产量起作用最大来讨论是很有意义的。     

类根瘤对烟草叶片中叶绿体及其淀粉粒含量的影响

目的：探讨类根瘤对烟草叶片中的叶绿体及其淀粉粒含量的影响。方法：无菌培养烟草再生植株,其中一部分经过一定浓度的2,4－D与豇豆根瘤菌512快生型突变株菌液诱导处理,另外一部分为对照。运用常规电镜技术制作叶片厚切片,通过显微观察,对两组烟草叶片细胞中的叶绿体及其淀粉粒含量进行对比分析。结果：结瘤植株叶片细胞内的叶绿体含量虽然与对照之间无明显差异,但叶片栅栏组织和海绵组织细胞内淀粉粒的含量却均较对照减少,其中前者减少更为明显（P＜0.05)。结论：结瘤烟草叶片内光合产物的大量同化可能与类根瘤的形成有关。     

小麦与叶锈菌互作过程中细胞程序性死亡的细胞学观察

小麦(Triticum aesetivum)品种洛夫林10和叶锈菌(Puccinia recondita f.sp tritici)小种162、165分别组成不亲和组合与亲和组合。透射电镜观察表明,在小麦与叶锈菌的不亲和组合中,接种后12h,侵染点周围叶肉细胞核变形;接种后24h,核内染色质开始凝聚,并趋于细胞核边缘,同时叶绿体膨胀;接种后48h,核内染色质凝聚加剧,叶绿体开始解体;最终在接种后72h,细胞核、叶绿体完全解体,线粒体开始退化。此外,内质网和液泡共同行使溶酶体功能,吞噬各种细胞器残体及原生质降解组分。以上结果表明：在小麦与叶锈菌不亲和组合的互作过程中,寄主细胞呈现细胞程序性死亡的典型特征。而在亲和组合中,叶肉细胞间隙中可见有大量菌丝蔓延,菌丝与寄主细胞壁接触后分化产生吸器母细胞。菌丝的存在对寄主细胞的超微结构产生一定影响。从接种后24h开始,与菌接触的细胞出现质膜下陷,叶绿体稍显膨胀;在接种后48h、72h,大部分叶绿体膨胀,而其它细胞器无明显变化。     

豌豆过氧化氢酶在烟草叶绿体中的过量表达提高了植物的抗逆性

通过构建融合番茄RuBP羧化酶小亚基转运肽基因(rbcS-3)和CAT基因编码阅读框(ORF)的双元表达载体,采用农杆菌介导的叶圆盘转化法将融合基因转入烟草,使其能够定向导入叶绿体中发挥作用。在含有50mg/L潮霉素的培养基上筛选获得转CAT烟草30多个株系,并对其进行了分子生物学的验证和生理指标的检测。对获得的抗性植株用PCR、RT-PCR、植株总蛋白Western blot和叶绿体蛋白Western blot分析表明,目的基因已经整合到烟草基因组中,并能正常表达,且在叶绿体rbcS-3转运肽的作用下能定向进入叶绿体中。对转基因植株生理指标的检测发现,在20% PEG₆₀₀₀模拟干旱条件下,野生型烟草的相对电导率提高幅度为43.4%,而转CAT植株的相对电导率仅提高8.8%,表明在干旱胁迫下转CAT烟草的质膜透性小于野生型烟草;经20% PEG₆₀₀₀处理后,野生型和转CAT基因烟草的叶绿素含量都下降,下降幅度分别为68.0%和20.4%;另外,经20% PEG₆₀₀₀处理的野生型烟草叶片的Fv/Fm下降幅度为5.3%,而转CAT基因烟草叶片的Fv/Fm下降幅度0.9%,这些结果表明,在叶绿体中过量表达CAT对干旱胁迫下的细胞质膜、叶绿素和PSⅡ具有一定的保护作用。此外,经150 μmol/L百草枯处理后发现,处理3h后,野生型烟草和转CAT烟草的相对电导率分别比对照提高67.9%和13.5%,而野生型和转CAT烟草的Fv/Fm都下降,降幅分别为23.7%和3.9%,这表明在百草枯氧化胁迫下转CAT烟草的质膜和PSⅡ的损伤程度都小于野生型烟草。总之,豌豆CAT基因在烟草叶绿体中过量表达,提高了转基因烟草的抗旱性和抗氧化性。     

过量表达番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（StAPX）提高了烟草种苗的抗氧化能力

为了探讨叶绿体类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶（tAPX）与其抗氧化性的关系,从番茄叶片中分离了叶绿体类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（StA跚并转入到烟草中。以野生型（WT）、转正义StAPX烟草株系T3-3和T3-6为试材,测定了外源过氧化氢诱导的氧化胁迫条件下APX酶活性、过氧化氢酶（CAT）活性、过氧化氢（H2O2）含量、叶绿素荧光参数及叶绿素含量等。Northern杂交显示StAPX因的表达受外源H2O2氧化胁迫的诱导。氧化胁迫下转基因烟草的APX酶活性和清除H2O2的能力都显著高于野生型,并且转基因烟草比野生型具有更高的PSII最大光化学效率及叶绿素含量。结果表明,．刚尸舶勺过量表达有助于提高外源H2O2诱导的转基因烟草的抗氧化能力。