赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）Toll样受体3（Toll-like receptor 3,ScTLR3）基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到ScTLR3基因cDNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过Real-Time qPCR技术,检测了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:ScTLR3基因cDNA序列全长4043 bp,包括5-非编码区（UTR）216 bp,开放阅读框（ORF）2715 bp和3-UTR 1112 bp;ScTLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 kD,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,ScTLR3由N端的信号肽（SP）、富亮氨酸结构域（LRRs）、跨膜结构域（TM）和C端的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）组成。实时荧光定量结果显示,ScTLR3mRNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织（P0.01）;感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中ScTLR3 mRNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,ScTLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。     

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。     

鸡TRIM25蛋白可促进宿主对禽流感病毒的天然免疫应答

TRIM家族蛋白在抗病毒天然免疫中发挥着重要作用.然而,鸡TRIM25(chicken tripartite motif25,chTRIM25)蛋白对禽流感病毒复制的影响仍不明确.本文旨在克隆chTRIM25基因并初步分析其功能.首先应用RT-PCR方法,从鸡成纤维细胞(chicken embryo fibroblast, CEF)中扩增chTRIM25基因.序列分析发现, chTRIM25基因可读框全长1902 bp,编码633个氨基酸,预测其分子量为71.42 kD.结构预测发现, chTRIM25蛋白的21～66位氨基酸为RING结构域, 110～146位氨基酸为B-box1结构域, 160～189位氨基酸为B-box2结构域, 208～311位氨基酸则为卷曲螺旋结构域, 465～633位氨基酸则为B30.2结构域.同源性分析发现,鸡TRIM25与鸭和鹅TRIM25氨基酸序列同源性在74%～77%,具有较高的同源性;而鸡TRIM25与人和鼠TRIM25的氨基酸序列同源性在46%左右,同源性较低.荧光定量实验发现,在禽流感病毒感染CEF后, TRIM25及相关抗病毒相关因子的表达量上调;也发现,TRIM25可以促进流感病毒对天然免疫信号通路的激活.这为深入了解TRIM25基因在禽流感病毒感染宿主后激发的宿主抗病毒天然免疫应答提供实验基础.     

卵形鲳鲹组织蛋白酶B基因的克隆及表达分析

为研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)组织蛋白酶B(Cathepsin B, CatB)基因的表达特征和功能, 应用RT-PCR和RACE技术获得卵形鲳鲹CatB(TroCatB)基因的全长cDNA。TroCatB cDNA全长为2181 bp。其中5′UTR和3′UTR分别为391和797 bp, ORF为993 bp, 推定编码330个氨基酸残基, 推定分子质量和理论等电点分别为36.37 kD和5.73。蛋白结构预测TroCatB蛋白具有信号肽(1Met-18Ala)、前体肽(25Leu-64Gly)和一个典型木瓜蛋白酶家族半胱氨酸结构域, 含107Cys、277His、297Asn 3个蛋白酶催化活性位点。同源性分析显示TroCatB蛋白与其他脊椎动物的同源性为67.0%—90.9%, 成熟肽区与其他脊椎动物的同源性为73.7%—92.4%。NJ系统发育树显示卵形鲳鲹和其他鱼类聚为一支, 与髙体鰤距离最近。实时荧光定量PCR检测TroCatB基因mRNA在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达, 在脾脏中表达最高; 在溶藻弧菌感染后, TroCatB基因在脾脏、头肾组织中的mRNA表达水平显著上调(P<0.05), 脾脏在感染6h后, 其表达量达到峰值, 头肾则是在12h达到峰值。以上结果表明, TroCatB蛋白的结构域和催化活性位点在遗传进化过程中保守, TroCatB基因参与了机体对细菌免疫的相关生理活动, 在卵形鲳鲹先天性免疫防御中发挥重要作用, 为进一步阐明TroCatB在免疫过程中的功能以及其对病原的抗病机理提供参考。     

尼罗罗非鱼Ikaros基因的克隆及表达分析

为揭示尼罗罗非鱼Ikaros基因结构特征及其在抗病原感染中的免疫调控机制, 实验采用RT-PCR和RACE方法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros的cDNA序列以及利用PCR和染色体步移技术克隆了Ikaros的基因组DNA序列, 通过荧光定量PCR分析了Ikaros mRNA的组织分布及其对无乳链球菌感染的响应。结果表明, 克隆的尼罗罗非鱼Ikaros基因组DNA为20454 bp, 包括7个内含子和8个外显子, 经可变剪接可形成6种不同的mRNA剪接异构体, 其编码的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的锌指结构域且与硬骨鱼类Ikaros氨基酸序列同源性较高(70.6%—93.7%)。Ikaros基因在尼罗罗非鱼各组织中均有表达, 在血液中的表达量最高, 其次为胸腺、脾脏和头肾。人工感染无乳链球菌后, 血液、胸腺、脾脏、头肾中Ikaros基因的相对表达量均显著上调, 并在48h达到峰值, 这表明Ikaros基因参与调控尼罗罗非鱼抵御无乳链球菌的免疫应答反应。研究可为进一步探索Ikaros基因在罗非鱼抗病原感染中的作用机制奠定理论基础。     

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织（肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢）中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织（肝脏、肠、脾脏和头肾）中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、葡聚糖（WGP）、聚肌胞苷酸（poly I:C）4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。     

杂交鳢TRAF2基因克隆、组织分布及对病原菌感染的应答分析

肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)是一种重要的胞内信号接头蛋白,参与激活NF-κB和MAPK信号通路,在免疫防御、炎症反应和细胞凋亡等过程发挥关键作用.为了探索杂交鳢(Channa maculate ♀ x Channa argus ♂)TRAF2功能及其对两种病原菌感染的应答机制,本研究克隆获得杂交鳢TRAF2(命名为CmaTRAF2)基因的完整开放阅读框(ORF),长度为1 566 bp,预测编码521个氨基酸,与龟壳攀鲈(Anabas testudineus)、杜氏鰤(Seriola dumerili)TRAF2蛋白序列相似性最高,都达到91％.与其他TRAF2相似,CmaTRAF2具有一个RING结构域、一个锌指结构域、一个TRAF结构域.系统发育分析表明CmaTRAF2与其他硬骨鱼类TRAF2聚为一支,其中与龟壳攀鲈TRAF2的亲缘性关系最近.实时荧光定量PCR检测分析显示CmaTRAF2在健康杂交鳢所检测的9种组织中广泛分布,其中脾脏中表达量最高,头肾中的表达量次之,肝脏中的表达量最低.采用鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)腹腔注射感染杂交鳢后,肝脏、脾脏和头肾中CmaTRAF2的表达在感染后不同时间点总体呈现为上调趋势,且分别在10h、l d和2d时达到最大值(P＜0.05).舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)注射感染杂交鳢后,CmaTRAF2的表达变化相似,也主要呈现上调趋势,且分别在肝脏、脾脏和头肾中于12 h、5 d和2 d时达到峰值(P＜0.05).以上结果表明,CmaTRAF2参与了杂交鳢抵御鰤诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌感染的免疫应答反应.本研究可为进一步探索鱼类TRAF2的免疫防御和信号转导机制提供基础资料.     

大黄鱼ATG10基因的分子特征及其在抗病毒免疫中的功能

为了研究自噬相关基因ATG10(Autophagy related gene 10)在鱼类免疫应答中的功能, 研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)ATG10基因(LcATG10)的cDNA序列, 其开放阅读框全长747个核苷酸, 编码248个氨基酸的蛋白, 包含1个Autophagy_act_C结构域。系统进化分析显示, LcATG10和其他硬骨鱼类ATG10聚成一支, 与金头鲷和石斑鱼ATG10亲缘关系最近。LcATG10在所检测的正常大黄鱼各组织中都有表达。在病毒类似物poly (I:C)刺激后, 大黄鱼脾脏和头肾组织中LcATG10的表达水平显著上调, 分别在12h和6h达到峰值(9.4和5.9倍)。LcATG10在大黄鱼头肾细胞系(LYCK)、原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中也均有表达, 在原代粒细胞中的表达量相对较高; 在poly (I:C)刺激后, 大黄鱼原代头肾粒细胞和LYCK细胞中LcATG10的表达水平显著上调。过表达LcATG10的鲤上皮瘤(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus, SVCV)感染48h后, 细胞病变效应(Cytopathic effects, CPEs)明显低于对照组; 细胞培养上清中SVCV病毒滴度为103.55 TCID₅₀/mL, 显著少于对照组; SVCV标志基因SVCV- G、SVCV-M和SVCV- P的表达水平也显著低于对照组, 分别是对照组的0.022、0.015和0.022倍。这些研究结果表明LcATG10在大黄鱼抗病毒免疫应答中发挥作用, 为深入研究自噬在大黄鱼抗病毒免疫中的分子机制奠定了基础。     

草鱼TRIM32基因克隆表达及功能研究

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是机体先天性免疫的重要成员, 参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程。为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用, 实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长, 共1980 bp, 编码660个氨基酸。草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域, 与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高, 遗传进化分析也聚为一支。间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达, 主要以点状分布在细胞质中, 细胞核中表达量较少; 组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达, 其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织; 不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明, TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05), 随后表达量下降, 直到出膜后表达量再次显著性升高。此外, 双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路, 诱导下游的炎症反应。结果显示, 草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内, 并参与机体的天然免疫反应, 对于抵抗病原体的入侵具有重要作用。     

热应激对虹鳟CRT基因和PDIA4基因mRNA表达的影响

在转录组测序研究中,筛选出了与虹鳟热应激相关的钙网蛋白基因CRT和蛋白二硫键异构酶基因PDIA4。为研究其在热应激过程的表达变化规律及应答机制,本试验以全同胞虹鳟为研究对象,通过持续升温,分别在18℃(对照组)、21℃、23℃、24℃、25℃和26℃下随机挑选3尾虹鳟,采用实时荧光定量(Real-time FQ-PCR)方法测定并分析了肝脏和头肾CRT和PDIA4 mRNA的表达变化特征。结果显示,与18℃相比,肝脏、头肾CRT表达量分别在24℃、26℃时显著上调且达到最高(19.16倍和2.76倍, p0.05);PDIA4 mRNA表达量分别在25℃、26℃显著上调且达到最高(57.45倍和188.68倍, p0.05)。肝脏CRT的表达量在24℃和25℃时显著高于头肾(10.89倍和8.46倍, p0.05),而PDIA4表达量在24℃、25℃和26℃时显著低于头肾(p0.05)。因此认为,热应激诱导虹鳟肝脏、头肾中CRT和PDIA4 mRNA的表达上调,25℃以上时,虹鳟热应激反应强烈,且对基因表达水平的影响存在组织特异性,肝脏对热刺激的反应比头肾更敏感。本研究为阐述鱼类在热应激下适应性保护机制提供指导。     

Cloning and molecular characterization of lycC1INH genes in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)

Complement component 1 inhibitor (C1INH) is a crucial protein in controlling activation of many plasma mediator pathways and can directly interact with Gram negative bacteria. The full-length cDNA of lycC1INH gene was identified from the large yellow croaker. It is of 2046 nucleotides (nt) encoding a protein of 599 amino acids, with a 5′-untranslated region of 99 nt and a 3′-untranslated region of 147 nt including the poly (A) tail. The deduced protein contains a C-terminal serpin (serine protease inhibitor) domain, and two N-terminus immunoglobulin domains without significant homology to other species. Western blot analysis of the protein expression showed that the expression of lycC1INH was obviously up-regulated in liver, spleen and head kidney of the fish challenged by attenuated live Vibrio anguillarum strain. This indicated that lycC1INH might be involved in the immune response of large yellow croaker to bacterial challenge.     

大黄鱼HIF-1α基因的克隆鉴定与表达分析

为研究低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在鱼类免疫应答中的作用, 研究克隆得到了大黄鱼(Larimichthys crocea)HIF-1α基因(LcHIF-1α)的cDNA序列, 其开放阅读框全长2256个核苷酸, 编码一个751个氨基酸的蛋白。通过氨基酸序列比对发现, LcHIF-1α蛋白具有5个典型的功能结构域, 包括1个helix-loop-helix(HLH)结构域, 2个PAS结构域, 1个DNA结合结构域(HIF-1)和1个羧基端反式激活结构域(HIF-1a_CTAD)。系统进化分析显示, LcHIF-1α和其他硬骨鱼类HIF-1α聚成一支, 与两栖类、鸟类和哺乳类HIF-1α的亲缘关系相对较远。序列分析结果表明, LcHIF-1α具有保守的特征结构域, 预示着其功能可能与哺乳动物HIF-1α类似。荧光定量PCR结果显示, LcHIF-1α在所检测的健康大黄鱼各个组织中都有表达, 在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后, 大黄鱼脾脏和头肾组织中的LcHIF-1α表达水平显著上调, 达到峰值时分别上升了6.8倍和2.9倍。此外, LcHIF-1α在大黄鱼的3种免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)中也都有表达, 在中性粒细胞和巨噬细胞中的表达量相对较高; 在脂多糖(LPS)诱导后, 中性粒细胞和巨噬细胞中LcHIF-1α的表达量显著增加, 峰值分别是对照组的2.6倍和1.8倍, 这些结果表明LcHIF-1α可能参与调控大黄鱼抗细菌免疫应答。     

黄颡鱼FTR67基因的克隆及功能研究

鱼类TRIM(Tripartite motif)家族的特异性扩张产生了一个硬骨鱼类特有的亚家族finTRIM (Fish novel TRIM, FTR),为探究finTRIM在黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)先天抗病毒免疫中发挥的作用,文章鉴定了1个与斑马鱼(Danio rerio) FTR67同源性较高的黄颡鱼finTRIM基因,命名为TfFTR67 (Tachysurus fulvidraco FTR67)。系统进化树分析表明, FTR67在有些鱼类物种中发生了基因重复,导致基因拷贝增多。TfFTR67不受SVCV的诱导表达,是一个组成型表达的基因。过量表达TfFTR67抑制poly(I﹕C)及RLR信号分子诱导的干扰素反应,同时促进病毒在细胞中的复制。鉴于TfFTR67与斑马鱼FTR67的表达特征和功能不同,研究结果表明,鱼类FTR67在不同物种中发生了基因重复和功能歧化。     

Molecular characterization and expression analysis of interferon- inducible protein 56 gene in large yellow croaker Pseudosciaena crocea

In mammals, interferon-inducible protein 56 (IFI56) has been considered to play a role in mediating inhibition of viral replication and cell growth, and possibly in mediating cell apoptosis. Here, we reported the cloning of an IFI56 homologue from the spleen of large yellow croaker, a marine fish (LycIFI56). The complete cDNA of LycIFI56 gene is 1628 nucleotides (nt) encoding a protein of 437 amino acids (aa), with a putative molecular weight of 50.8 kDa. The deduced LycIFI56 protein has a high-level homology with all members of IFIT (IFN-inducible proteins with TPR domain) family, and its 9 putative TPR motifs all locate the corresponding position of these IFIT proteins. Phylogenetic analysis showed that five fish IFIT members form a unique clad independent of mammalian homologues, reflecting a distant evolutionary relationship from mammals. LycIFI56 gene was constitutively expressed in various tissues examined, such as gills, intestine, liver, kidney, heart, spleen, muscle and blood. Upon induction with poly(I:C), LycIFI56 gene expression is obviously up-regulated in spleen, gills, intestine, liver and kidney at 24 h post-induction, suggesting that LycIFI56 may be involved in the immune response induced by poly(I:C). Analysis of the expression kinetics of LycIFI56 and IRF1 genes revealed that the up-regulation of LycIRF-1 expression by poly (I:C) was apparently earlier than that of LycIFI56. These results would facilitate a better understanding of the expression regulation of fish IFI56 gene, and of its roles in immunity of bony fish.     

Characterization of a RacGTPase up-regulated in the large yellow croaker Pseudosciaena crocea immunity

The Rac proteins are members of the Rho family of small G proteins and are implicated in the regulation of several pathways, including those leading to cytoskeleton reorganization, gene expression, cell proliferation, cell adhesion and cell migration and survival. In this investigation, a Rac gene (named as LycRac gene) was obtained from the large yellow croaker and it was expressed in Escherichia coli and purified. Subsequently the specific antibody was raised using the purified fusion protein (GST-LycRac). Moreover, the GTP-binding assay showed that the LycRac protein had GTP-binding activity. The LycRac gene was ubiquitously transcribed and expressed in 9 tissues. Quantitative real-time RT-PCR and Western blot analysis revealed the highest expression in gill and the weakest expression in spleen. Time-course analysis revealed that LycRac expression was obviously up-regulated in blood, spleen and liver after immunization with polyinosinic polycytidynic acid (poly I:C), formalin-inactive Gram-negative bacterium Vibrio parahemolyticus and bacterial lipopolysaccharides (LPS). These results suggested that LycRac protein might play an important role in the immune response against microorganisms in large yellow croaker.     

敲除trim47基因斑马鱼脑和脾的比较转录组学分析

用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47, 收集TRIM47–/–(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析, 以鉴定差异表达基因(DEGs)。总共确定了271个DEGs, 经过简要分析, 将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析, 与WT组相比, TRIM47-/-组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中。在脾脏中, 与野生型组相比, TRIM47-/-组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化。使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因, 与转录组数据一致。这些结果表明, Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用, 尤其是通过补体途径参与先天免疫功能。体内感染实验表明, trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率。总之, 这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索。