翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT－PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系（PVY^N）的可翻译和不可翻译外壳蛋白（CP）基因,并分别插入pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的基因转化方法,将可翻译和不可翻译的PVY^N-CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中,得到抗卡那霉素的再生植株,对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的95％和98％。攻毒实验表明,两种类型的转基因烟草对PVY^N的抗病性具有相似性,其表现型为：免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明,在表达不可翻译PVY^N－CP基因的转基因植株内 以CP蛋白,而在导入可翻译的PVY^N-CP基因的植株内检测到了CP蛋白,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明,表达可翻译与不可翻译PVY^N-CP基因的转基因烟草对PVY^N的抗病性均为RNA介导的抗病性。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.).Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默.发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录.利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默.进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默.对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加.     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默。发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录。利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默。进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默。对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加。     

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略.马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失.本文以PW的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300 bp和354 bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVY CP同源的hairpin RNA.结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染.     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virus, PLRV)中国分离株的基因间隔区(intergenic sequence, IS)双链cDNA以正、反向两种方式分别构建于转化载体pROK2中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Desiree,获得了转基因植株.卡那霉素抗性分析和PCR检测目的基因,证明PLRV IS双链cDNA已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中.将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种PLRV,观察症状并用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测转基因植株中PLRV含量.结果表明,表达PLRV IS正意和反意RNA的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,PLRV平均滴度均较未转基因对照植株低.表达正意RNA的转基因植株PLRV滴度降低43%～72%,表达反意RNA的转基因植株PLRV滴度降低72%～86%,由此可见,表达PLRV IS反意RNA的转基因马铃薯对PLRV抗性较强.     

黄瓜花叶病毒卫星RNA致弱辅助病毒的机理

分析了卫星RNA致弱的黄瓜花叶病毒 (CMV)侵染的烟草叶绿体内的CP浓度与花叶症状的严重程度成正相关 .用番茄不孕病毒 (TAV)接种表达CMV卫星RNA的转基因烟草叶绿体中 ,TAV- CP含量明显比不含卫星RNA的TAV株系侵染的低 ,而在细胞质中TAV -CP含量无差别 .用完整游离叶绿体进行体外跨膜运输试验 ,CMV- CP能快速进入离体叶绿体 ,CP降低叶绿体动力学荧光光谱 .将CMV的CP基因与 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基引导肽基因进行体外拼接 .借助农杆菌转化烟草 .转基因烟草表现出黄化、根系发育受抑制 ,产生类似病毒侵染的症状 .     

转不可翻译PVYN CP基因烟草的抗病性分析

我们曾报道表达不可翻译PVY~N CP基因的转基因烟草抗病性是由RNA介导的,其抗病性类似于转录后的基因沉默(PTGS)。本研究以这类不同抗性的Tn代转基因烟草植株为材料,对自交后的T1代转基因植株的遗传和抗病性进行了分析,并选取部分T_1代抗病株系自交留种。对T_2代RNA介导抗病性转基因植株进行了分子分析和一系列抗病性研究。结果表明,含1-2个转基因拷贝的T_0代感病植株,在T_1代中的Km抗性分离符合单位点插入的3∶1的遗传规律;含3个或3个以上转基因拷贝的T_0代中抗或高抗植株,在T_1代中的Km抗性分离符合多位点插入的15∶1或63∶1的遗传规律。大多数T_1、T_2代转基因植株的抗病性与转基因拷贝数成正相关,转基因在T_1、T_2代植株中能够转录表达,且转基因植株之间转基因mRNA在细胞质中的积累水平与转基因植株的抗病性成负相关。转基因植株的抗病性能够在T_1、T_2代中遗传,且T_2代转基因植株的抗病性具有以下特征:1)既抗病毒粒体又抗病毒RNA的侵染,且这种抗病性不受接种物剂量的影响;2)抗病谱较窄,只对PVY的某些株系具有高度抗病性;3)与传毒方式无关,既抗摩擦接种又抗带毒蚜虫接种;4)与植株的发育阶段没有关系。     

转不可翻译PVY^N CP基因烟草的抗病性分析

我们曾报道表达不可翻译PVY^N CP基因的转基因烟草抗病性是由RNA介导的,其抗病性类似于转录后的基因沉默(PTGS)。本研究以这类不同抗性的T0代转基因烟草植株为材料,对自交后的T1代转基因植株的遗传和抗病性进行了分析,并选取部分T1代抗病株系自交留种。对T2代RNA介导抗病性转基因植株进行了分子分析和一系列抗病性研究。结果表明,含1—2个转基因拷贝的T0代感病植株,在T1代中的Km抗性分离符合单位点插入的3：1的遗传规律;含3个或3个以上转基因拷贝的T0代中抗或高抗植株,在T1代中的Km抗性分离符合多位点插入的15：1或63：1的遗传规律。大多数T1、T2代转基因植株的抗病性与转基因拷贝数成正相关,转基因在T1、T2代植株中能够转录表达,且转基因植株之间转基因mRNA在细胞质中的积累水平与转基因植株的抗病性成负相关。转基因植株的抗病性能够在T1、T2代中遗传,且T2代转基因植株的抗病性具有以下特征：1)既抗病毒粒体又抗病毒RNA的侵染,且这种抗病性不受接种物剂量的影响;2)抗病谱较窄,只对PVY的某些株系具有高度抗病性;3)与传毒方式无关,既抗摩擦接种又抗带毒蚜虫接种;4)与植株的发育阶段没有关系。     

植物转基因沉默研究进展

随着转基因技术在植物中的广泛应用,转基因沉默受到越来越多的重视。转基因沉默可发生在转录和转录后两种水平,其基本特征就是依赖于同源的重复序列。转基因的重复拷贝间,转基因与同源的内源基因间及RNA病毒与同源转基因间都会发生基因沉默。可能有不同的机制导致转基因沉默,本文综述了转基因沉默的机理研究及转基因沉默在植物抗病基因工程和植物功能基因组学方面的应用 。     

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no. HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。     

外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达

依据RNA干涉机制,以TMV复制酶基因为靶标基因,针对TMV 5个株系复制酶基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR反应获得靶序列,构建靶序列反向重复结构的RNA干涉双元载体.用根癌农杆菌介导将外源基因转化至烟草品种K326基因组中,培育RNA干涉转基因烟草.人工接种病毒验证转基因烟草中外源基因在植物抗病毒能力方面的表达效果,实时荧光定量PCR分析转基因烟草抗病毒能力.结果表明,实验培育的RNA干涉转基因烟草67%对TMV呈现高度抗性;荧光定量PCR分析显示,对TMV具高度抗性的转基因烟草中病毒复制酶基因转录产物mRNA存在很大程度的降解,证实了RNA干涉技术在培育抗病毒烟草品种中的效果.     

转录后基因沉默的机制及其应用

确定导致转录后基因沉默的原因,探索在转基因植物研究中避免基因沉默的对策。方法是将转基因沉默分为转录水平的沉默和转录后水平的沉默,分别对RNA阈值模型、异位配对和异常RNA模型、双连RNA模型等几种导致转录后基因沉默模型的分析。结果确定了转基因沉默抑制现象和转录后基因沉默的形成机制,以及转录后基因沉默理论和实践意义。提出了利用RNAi等技术进行基因功能鉴定和利用基因沉默进行病毒防治的策略。     

病毒诱导烟草的基因沉默

病毒诱导基因沉默是利用RNA介导病毒防卫机制的一项技术。构建含有目的基因片段的人工改造病毒载体,通过农杆菌侵染导致植物内源目的基因沉默。为建立病毒诱导基因沉默体系,选用烟草脆裂病毒（TRV）和烟草为实验材料。构建了八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS）的基因沉默病毒载体,病毒载体侵染结果显示目的基因PDS沉默导致烟草幼苗出现光漂白现象。采用RT-PCR的方法检测目的基因PDS的沉默效果,结果显示PDS基因mRNA被显著降解。该体系的建市有利于将来对植物基因进行高通量功能分析。     

改造的马铃薯Y病毒复制酶基因介导高度抗病性

提取马铃薯Y病毒中国分离株(PVY—c)的mRNA作为模板,随机六聚脱氧核苷酸和寡聚dT为引物合成了单链cDNA。通过聚合酶链式反应(PcR)获得了PVY—C的核内含体b(Nib)全长cDNA克隆。在对其进行全序列分析的基础上,构建了PVY—CNIb基因全长．5’端缺失381个碱基和Nib反义RNA三种不同形式高等植物表达载体。在土壤农杆菌LBA4404的介导下,转化烟草生产品种NC89,获得了所有三种表达载体的转基因植株。通过分子生物学检测和抗性分析发现不同形式的Nib基因序列的转基因植株对马铃薯Y病毒表现不同程度的抗性。其中,以5’端缺失的Nlb的基因转化植株表现最好,从总共20个这类转化株系中筛选到4个株系至少在100μg／m1 PVY—C接种浓度下,表现完全的抗病效果。从总共39个全长Nib基因转化株系中,仅有一个株系,在100μg／ml PVY—c的攻毒接种下具有完全的抗病性。所有33个Nib基因反义RNA的转化植株中,无一株系表现完全的抗病效果,但是有部分株系能不同程度地延缓或减轻发病程度,并有部分植株在发病后50d左右有恢复健康的趋势。虽然能够在上述3种形式的Nib基因序列的转基因植物中检测到相应的RNA的转录产物,但是均未能检测到其相应的蛋白表达产物。     

马铃薯泛素结合酶基因StUBC17的克隆与功能分析

泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme E2,UBC)与植物生长发育和抗病反应密切相关。为了解泛素结合酶基因对植物抗晚疫病的贡献,从马铃薯栽培种"合作88"中克隆出一个E2泛素结合酶基因,命名为StUBC17,并对其受晚疫病菌诱导表达特性及功能进行分析。利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术降低本氏烟(Nicotiana benthamiana)中StUBC17同源基因(NbUBC)的转录水平,再接种晚疫病菌进行抗病性鉴定。进一步在基因沉默植株上瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因(R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP)及INF1。StUBC17编码区全长447 bp,编码148个氨基酸,其蛋白分子量为16.52 kD,理论等电点为7.72。表达分析结果表明,StUBC17受晚疫病菌诱导表达。抗病鉴定结果显示,与对照植株相比,NbUBC沉默植株的抗病性显著降低。沉默NbUBC不影响过敏反应(Hypersensitive responses,HR)的发生。StUBC17是植物防御晚疫病所需,但该基因的沉默并不影响R3a、R3b、Rx及INF1介导的HR反应。     

利用转hpRNA基因水稻抗水稻矮缩病毒

具有发夹结构的双链RNA(hairpin RNA,hpRNA)能高效诱导转录后基因沉默的发生.以水稻(Oryza sativaL.)矮缩病毒(RDV)基因组中第八片段编码区128～754 bp的序列为臂构建hpRNA,并克隆到植物表达载体pROK-2上.通过农杆菌介导的方法转化水稻"中花11".Southern blot分析表明,共获得12株阳性转化体.用带有RDV的叶蝉(Nephotettix cincticeps)接种Tl代转hpRNA水稻,结果表明转基因水稻对RDV具有高抗性或表现为症状延迟.而相同序列的有义链的转基因水稻和空载体的转基因水稻表现为典型的RDV侵染症状.HpRNA在转基因水稻中对RDV高抗性发挥重要作用.     

植物遗传工程

920268抗病毒植物的遗传工程〔英〕/Godoni,F一ZAreh.Virol一2990,115(i一2)一i~22〔译 自DBA,1991,10(9),91一05050] 讨论的主要内容包括:用于交叉保护的外壳蛋 白序列对植物的转化,表达病毒外壳蛋白的转基因植物的田间试验,抗病毒侵染的反义RNA技术,病毒卫星RNA在植物中的表达,ribozyme和锤头RNA机制,作为受体专性抗病毒荆的抗个体基因型的抗体;人干扰素基因在转基因植物中的克隆和表达。构建了抗下列病毒的转基因植物,烟草花叶病毒、首藉花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等。外壳蛋白介导的保护是最广泛采用的…     

马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系（PVY－C）HC－Pro基因的5个缺失突变体,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化了烟草品种K326(Nicotina tabacum cv.k326)。PCR和Southern blot分析证明了HC－Pro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中,Western blot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HC－Pro中心区域介导转基因烟草中PVC－C和黄瓜花叶病毒（CMV）、PVY－C和马铃薯X病毒（PVX）之间的协生作用,从而明确了PVY－C HC－Pro中心区域为病毒协生作用的功能区域。     

转基因油菜中核酶介导的对花椰菜花叶病毒的高度抗病性

设计了特异切割花椰菜花叶病毒(CaMV,ds DNA病毒)35S RNA的锤头型核酶基因(Rz);同时将核酶保守区内的一个G碱基以U代替构成核酶突变体(mRz)作为对照.体外切割实验表明.Rz可按设计要求高效特异地切割355 RNA,而mRz则完全没有切割活性.将Rz和mRz克隆到pROK2构建成植物表达载体pROK2-Rz和pROK2-mRz.采用转化下胚轴法转化油菜,通过筛选获得转Rz和mRz基因油菜植株、攻毒实验证明Rz当代转化植株表现出对CaMV的高度抗病性,75%的植株不表现任何症状,也测不出CaMV的存在,其抗病植株的T₁后代的抗病性按孟德尔定律3:1分离.mRz当代转化植株及其T₁后代植株只具有极其微弱的减轻症状的作用.