第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂国家标准品的协作标定

为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品,以WHO97/616批重组人凝血因子Ⅷ浓制剂国际标准品为对照,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y.并将标准品分别置4℃、22℃、37℃保存4.5个月,用加速破坏试验进行稳定性考查.结果表明,X(20010606批)候选标准品效价为3.8IU/支;Y(20010607批)候选标准品效价为7 3 IU/支.X批候选标准品比Y候选标准品稳定性好.其它项目均达到国家标准品要求.故已完成建立第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂国家标准品.     

第三批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品的协作标定

为更替第二批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品,以WHO97/616批重组人凝血因子VⅢ浓制剂国际标准品为对照,采用一期法协作标定第三批人凝血因子Ⅷ浓制剂二个候选国家标准品X和Y,并将标准品分别置4℃,22℃,37℃保存4.5个月,用加速破坏试验进行稳定性考查,结果表明,X（20010606批）候选标准品效价为3.8IU/支;Y（20010607批）候选标准品效价为7.3IU/支,X批候选标准品比Y候选标准品稳定性好,其它项目均达到国家标准品要求,故已完成建立第三批人凝血因子VⅢ浓制剂国家标准品。     

无细胞百日咳菌苗的纯制和特性

<正> 引言 百日咳菌苗传统的形态,由杀死的百日咳杆菌组成,亦即它是全细胞菌苗。这种菌苗包含有对促进保护性应答不需要的成份,而且这些成份可能对副反应起作用。在日本,自1973年一直从事由百日咳杆菌分离其有效因子,并尽可能多的除去不需要的成份。一些保护性抗原已在百日咳杆菌培养物的上清液中被证实,并曾尝试发展一种由一或两种这些抗原组成的菌苗。含有两种主要保护性抗原即由百日咳杆菌培养物上清液中分离出的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)的精制百日咳菌苗(无细胞百日咳菌苗),自1981年已应用于日本.     

家蝇抗菌肽Defensin基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的:研究家蝇抗菌肽Defensin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达情况,并对表达产物的抗菌作用进行初步检测。方法:以Defensin基因为模板设计特异性引物,扩增在C端含6×His标签的Defensin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1( )进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1( )/Defensin-His 6。以阳离子脂质体LipofectamineTM2000为载体,对宿主细胞COS-7进行重组质粒pcDNA3.1( )/Defensin-His 6和空载体pcDNA3.1( )的转染,72h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-Trap HP亲合层析柱分离纯化和Western blotting鉴定后,进行杀菌活性的初步检测。结果:重组质粒pcDNA3.1( )/Defensin-His 6组细胞培养上清液的纯化物,行Western blotting得到了分子量大小约为10.0kD的单一目的条带,与预期相符;杀菌活性试验中发现:该纯化物对大肠杆菌E.coliK12D31具有一定的杀菌活性。结论:家蝇抗菌肽Defensin基因在宿主细胞COS-7中得到了正确表达。     

三个HIV-1广谱中和表位与HBV S抗原融合表达可诱导小鼠特异性抗体应答

为了增强HIV-1交叉中和表位的免疫原性,本研究使用PCR克隆技术将HIV-1三个具有一定广谱中和活性的线性抗原表位ELDKWA(简称2F5)、NWFDIT(简称4E10)和GPGRAFY(简称447-52D)基因分别融合到HBV S基因的3味端,构建了分别表达这三种融合基因的天坛株重组痘苗病毒疫苗RVJ1175S-2F5、RVJ1175S-4E10和RVJ1175S-447-52D,使用这三种重组痘苗病毒感染的细胞培养上清液经分离纯化制备了三种相应的蛋白亚单位疫苗PS-2F5、PS-4E10和PS-447-52D,对重组痘苗病毒和亚单位疫苗中三种融合抗原的生物学及免疫学特性进行了比较研究.PCR和测序结果表明,三种融合基因序列正确重组到痘苗病毒TK区,HBsAg的ELISA检测表明三种融合蛋白有效表达并分泌到细胞培养上清液中,SDS-PAGE凝胶电泳显示三种纯化后的融合蛋白均含分子量为23kD和27kD两种典型HBsAg条带,Western blot证明这两个条带均能与HBsAg抗体反应,并分别能与三种表位相应的HIV-1单抗2F5、4E10和447-52D反应.小鼠免疫结果显示,三种重组痘苗病毒疫苗和三种蛋白亚单位疫苗均能诱发较高水平的HBsAg抗体和相应HIV-1交叉中和表位抗体,蛋白亚单位疫苗诱生的这两类抗体均明显高于对应的重组痘苗病毒疫苗.这些结果为进一步研究三种表位抗体的中和活性和通过不同类型疫苗联合免疫进一步增强其免疫效果研究奠定了基础.     

融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究

目的:在毕赤酵母SMD1168中表达融合抗菌肽,并检测其体外抑菌活性。方法:本实验从实验室先前构建的重组质粒pVAX1-RHKJT中克隆出已构建好的融合抗菌肽RHKJT基因片段,将RHKJT基因片段插入至pGAPZaA真核表达质粒中,通过PCR和测序验证,构建pGAPZα-RHKJT重组真核表达质粒,将线性化的pGAPZα-RHKJT电转化至毕赤酵母SMD1168中获得重组酵母SMDp G-RHKJT,并通过PCR和RT-PCR验证,对重组毕赤酵母SMDpG-RHKJT进行发酵,并收集发酵上清液进行体外生物活性测定。结果:成功获得重组酵母SMDpG-RHKJT菌株,重组酵母发酵上清液对大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、沙门氏菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、肺炎链球菌标准菌均具有显著的抑菌活性。结论:重组酵母表达的融合抗菌肽具有较广的抗菌谱和较高的抑菌活性,具有良好的潜在应用前景。     

一种新阿片肽的分离纯化

报道了一种新阿片肽OP1的分离纯化。将重组毕赤酵母经适宜的生长和表达培养后,所得的发酵液经离心得无细胞上清液,上清液经超滤后过Sephadex G-10柱。将经Sephadex G-10柱所得具有阿片活性的粗组分用HPLC-MS分析,根据阿片肽N-端均有一个酪氨酸残基,且在肽链的第三或第四位上有一个芳香族氨基酸残基这一性质,依据分子量确定活性组分中可能存在的所有阿片肽,然后根据这些阿片肽的等电点,利用AKTA Purifier 100快速纯化系统的DEAE-阴离子交换纤维素柱将其进一步分离,活性组分再用Sephasil peptide C18反相高压液相柱分离得到活性组分OP1肽,鉴定纯度后测定其氨基酸组成。最后确定该肽的一级序列为YPFPGPIRYG,该阿片肽序列目前尚未见报道。     

第六届植物组织与细胞培养国际会议报道

第六届植物组织与细胞培养国际会议于1986年8月3～8日在美国明尼苏达州的Mineapolis举行,本届会议是由国际植物组织培养协会和明尼苏达大学组织的。来自57个国家的1525名代表出席了会议。这是组织培养研究人员的最大的一次集会。会上提出近350篇口头报告和450份墙报。下面是几篇会议报道。 1.谷类作物基因工程的进展本次会议提出的几篇报告表明,谷类作物基因工程中最后两个主要障碍已被克服。在谷物中已经完成了基因转化并且也已由原生质体再生出了植株。     

Raji细胞培养中HSV持续感染模型的建立及免疫因素(TNF IFNs)对它的影响

本文观察HSV持续感染Raji细胞培养物150天。发现整个感染过程似呵分为两个阶段:急性期(前30天)和稳定期(30天以后)。在急性期上清液中HSV滴度达10~(6.2)TCID_(50)/ml.病毒抗原阳性细胞达21％,死细胞达42％;在稳定期病毒和细胞处于相对平衡状态,上清液中IISV滴度在10~(3.5-4.2)TCID_(50)/ml,病毒抗原阳性细胞约占5—10％,感染细胞与对照细胞在生长特性上无明显差异。用rIFNs、rlL-2和TNF处理稳定期的细胞培养物,发现TNF和rlFNa能明显抑制HSV的复制,rIENy作用较弱,去除上述因子5天后又恢复到处理前水平。rlL-2无明显作用。用HSV抗体处理上述细胞培养物上清液中病毒和病毒抗原阳性细胞都消失,且在去除抗体后连续观察50天仍未出现。本实验为体外研究HSV持续感染提供了一个有用的模型。     

用基因重组方法生产微生物杀虫剂

<正> 据《生命工学》1986年第1期报道,日本住友化学工业株式会社建立了一种用基因重组方法生产苏云金杆菌制剂(BT剂)的新技术。该社试制了对甘蓝夜蛾有效的BT剂第1号,在此之前生产的BT剂对这种蔬菜害虫是没有杀虫效果的。BT剂原来的生产周期将近为1星期,而现在的新生产方法培养时间缩短为半天,而且,杀虫性蛋白质的活性也提高了将近两倍。通过使用大肠杆菌进行基因重组的方法,获得超过10万的高分子物质,这在世界上也是罕见的。     

人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的建立

目的:建立人促卵泡激素(FSH)体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证。方法:以人卵巢颗粒细胞KGN为基质细胞,用不同浓度的FSH与KGN细胞表面的FSH受体结合,刺激细胞产生不同浓度的孕酮,通过测定细胞培养上清中的孕酮含量来评价FSH的生物学活性,结果用国际标准品进行校正;对方法的专属性、线性与范围、回收率、精密度、耐用性进行验证;对市售FSH产品进行检测,并与传统动物体内活性检测结果进行比较。结果:KGN细胞对FSH有很好的剂量反应关系,方法专属性符合要求;线性范围为0.1~200 ng/m L,相关系数R2≥0.99;回收率为80%~120%;经3次重复测定,3批市售样品和3批自制样品的活性分别为(13.4±0.4)~(13.5±0.8)和(12.9±0.7)~(14.3±1.2)IU/μg,变异系数在15%之内;结果显示该方法有很好的耐用性。测定3批市售重组人FSH产品和1批尿源FSH国家标准品,其体外活性测定结果与传统动物体内活性测定结果一致。结论:建立并验证了一种利用KGN细胞体外测定FSH生物学活性的方法,有望代替传统的动物体内活性测定方法,可用于FSH的生物学活性评价和质量控制。     

连翘内生真菌的分离鉴定及其发酵液抑菌活性和HPLC测定

为获得能产生抑菌活性物质的连翘内生菌,从连翘新鲜组织中分离纯化内生真菌并进行形态学分析,牛津杯法测定发酵液的抑菌活性,对具有抑菌活性的菌株进行18S rRNA基因序列分析,并以连翘主要活性成分连翘苷和连翘酯苷A、B标准品为对照,HPLC测定发酵上清液中的连翘苷和连翘酯苷A、B含量。结果表明从连翘新鲜组织中获得了5株内生真菌,其中4株菌的发酵上清液对金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌有很好的抑菌活性,对这4株菌的分子生物学检测表明3株菌为枝胞菌,另1株菌为曲霉菌,HPLC结果显示这4株菌的发酵上清液中均含有一定浓度的连翘苷和连翘酯苷A、B,发酵液中发挥抑菌活性的成分是否与这三种物质有关需要进一步研究,但连翘内生真菌可以产生抑菌活性物质这一结果为后续利用微生物发酵生产抑菌物质提供了新的途径和新的菌种来源。     

重组马g-干扰素抗病毒活性测定及单克隆抗体抑制活性鉴定

为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马g-干扰素是否具有抗病毒活性, 利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78), 然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP), 观察干扰素对病毒表达GFP的抑制, 测出其抗病毒活性单位分别为1×103 AU/mL、1×105 AU/mL。评价了制备的九株抗重组马g-干扰素单克隆抗体是否可抑制重组马g-干扰素抗病毒活性, 证实其中一株可中和重组马g-干扰素的抗病毒活性。结果表明: 杆状病毒表达的马g-干扰素具有较高的抗病毒活性, 其活性可被一株制备的抗重组马g-干扰素单克隆抗体抑制; 首次获得原核表达的具有抗病毒活性的马g-干扰素。     

三得利公司开始αhANP第Ⅲ期临床试验

日本三得利公司已于10月开始αhANP(心钠素)的第Ⅲ期临床试验,它被用来治疗充血性心力衰竭的注射剂。早先进行了化学合成品的临床开发,接着基因重组产品的第Ⅱ期临床试验也已结束。采用哪种制剂进行第Ⅲ期临床试验,有待厚生省的批准。该公司已建立用20L的培养,生产13.2g αhANP的技术,但选择重组制法成本可能要高。     

用高效液相色谱测定重组人尿激酶原制剂的蛋白含量

目的:用RP-HPLC方法对注射用重组人尿激酶原制剂蛋白含量进行定量分析。方法:用反相C18柱、0.1%TFA水溶液与0.1%乙腈进行梯度洗脱,280nm波长紫外检测器监测;以重组人尿激酶原同质标准品作为对照品,根据进样量和相应的峰面积建立标准曲线方程,将待测定样品的峰面积代入标准曲线方程,可测得蛋白含量。结果:按照方法学验证要求对此方法进行了专属性、检测限、定量限、线形、精密度(重复性、中间精密度)、准确度(回收率)考察,线性范围为9～27μg,回收率在97%以上,RSD2.0%,完全满足对制剂蛋白的定量需求。结论:本方法准确,适用于注射用重组人尿激酶原成品制剂蛋白定量测定。     

利用超声波从植物细胞回收产物

植物细胞培养物产生的次生代谢物通常在液泡内浓集,而不释放到培养基中.为了回收这类产物,必需破碎细胞,这是一种不能由培养物进一步生产产物的高价方法.由植物细胞培养物生产次生代谢物的经济实用系统需要在不破坏细胞的条件下重复回收细胞产物的方法.这种技术已由剑桥大学的N.J.Kilby和Bristol Polytechnic的C.S.Hunter研究成功. Kilby和Hunter报道,当施以1.02MH_2连续超声波达30秒钟以上时,悬浮培养的甜菜     

光控诱导重组系统的开发与应用

位点特异性重组系统由重组酶和特异性识别位点两部分组成,是一种强大的基因操作工具,被广泛运用于生命科学研究。已开发的诱导型重组系统以时空方式精准调控细胞和动物的基因表达,被用于基因功能研究、细胞谱系示踪和疾病治疗等领域。根据诱导重组酶时空表达方式的不同,诱导型重组系统可分为化学诱导和光控诱导两种方式。光控诱导重组系统是利用光作为诱导剂,根据光控方式和对象的不同,可进一步分为光笼和光遗传学两类。光笼诱导重组系统是利用光敏基团来控制化学诱导剂或重组酶,光诱导前它们的活性被光敏基团抑制;在特定光照射后,它们的活性被恢复,进而实现光控诱导基因重组。光遗传学诱导重组系统是通过光遗传学开关介导分割型重组酶的重新激活来诱导基因重组。其中光遗传学开关由一系列基因编码的光敏蛋白组成,包括隐花色素、VIVID蛋白、光敏色素等。这些类型丰富的光控诱导重组系统为从高时空分辨率的维度解析基因的表达和功能提供了更多的工具,以满足日益复杂的生命科学研究需求。本文主要对不同类型光控诱导重组系统的开发原理及应用进行综述,比较其优缺点,最后对未来开发更多光控重组系统进行展望,旨在为系统优化升级提供理论基础和指导。     

家禽活体疫苗获得许可

美国农业部已批准Syntro Corporation公司重组病毒疫苗的商品化。该疫苗能保护雏鸡免遭鸡新城疫病毒和鸡痘病毒的侵染。这是第一个Ⅲ级疫苗,即被美国公认许可应用的一种携带基因修饰的活体疫苗。 该疫苗称为Vector Vax FP-N,是由Syntro公司与日本公司Nippon Zeon合作开发研制的。美国农业部详细说明了三类重组疫苗,头两类属于失活疫苗和带有缺失的活体疫苗。本文批准的疫苗是将两个鸡新城疫病毒蛋白基因导入失活的鸡痘病毒产生的。Syntro-Zeon公司准备在1995年期间使Vector Vax     

草鱼、中华鳖脾细胞培养上清液ＩＬ—２物质的检测

用刀豆蛋白Ａ（ConA)刺激诱导草鱼和中华鳖脾细胞,收细胞培养上清液,用小鼠胸腺细胞增殖试验和对小鼠Ｌ９２９细胞系杀伤试验检测上清液中白细胞介素－２（简称ＩＬ－２）活性。结果表明：草鱼、中华鳖脾细胞培养上清液中有ＩＬ－２样活性物质,这种物质使小鼠的胸腺细胞^3H-TdR掺入量明显增加,在相同效靶比的条件下对小鼠Ｌ９２９细胞系杀伤率也显著增强,这种ＩＬ－２活性均能被抗人rIL-2血清所抑制。中华鳖脾细胞培养上清液（含ＩＬ－２）对中华鳖胸腺细胞也有较明显的促增殖作用并能消除兔抗中华鳖胸腺细胞血清（ＲＡＴＴＳ）对中华鳖胸腺细胞增殖的抑制作用,进一步用抗人白细胞分化抗原ＣＤ２５（ＩＬ－２受体,简称ＩＬ－２Ｒ）单克隆抗体进行免疫组化交叉反应提示草鱼、中华鳖淋巴细胞膜上含有与人类ＩＬ－２Ｒ类似功能和结构的物质。     

几种中药及其有效成分对人体肿瘤细胞增殖的抑制作用

通过建立的抗肿瘤体外模型,对临床上有抗肿瘤作用的几种中药提取物的抗肿瘤的活性进行检测。并与其中用作标准品的化学成分的活性进行比较。结果发现所检测的中药牛蒡子、蛇床子、三七、大黄、茯苓、延胡索、川乌和黄芪等的水提物和醇提物对肿瘤细胞株均有一定的抑制作用,醇提物的活性明显高于水挺物。一部分用作标准品的化学成分也有抗肿瘤活性。这项工作为抗肿瘤活性成分的筛选建立了有效的方法和基础。