基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化

【背景】血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichiacoli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】PCR法克隆集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD_(600)约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30°C诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶的纯化与结晶条件

【目的】在大肠杆菌中克隆表达尼古丁降解关键的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶基因hspB,纯化重组HspB蛋白并进行结晶条件的初步研究。【方法】从恶臭假单胞菌S16基因组中PCR扩增hspB基因,构建重组表达载体pET28a-hspB,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对HspB蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】本文成功构建重组质粒pET28a-hspB并纯化获得达到结晶纯度的HspB蛋白。结晶条件初筛和优化后获得可培养HspB蛋白晶体的条件为0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L HEPES pH 7.5、1.1 mol/L(NH4)2SO4、4°C、加晶种。【结论】HspB蛋白纯化体系的构建和结晶条件的初步研究为从结构生物学的角度进一步研究HspB结构与功能的关系、定向进化提高HspB催化效率奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862 金属蛋白酶活性的体外鉴定

【目的】金属蛋白酶S2P在细菌中通过在膜切割转录调控因子、释放δ因子参与胁迫响应是跨膜信号转导的保守机制,但蓝细菌中S2P的功能还未被鉴定,故我们考察集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862的金属蛋白酶活性。【方法】以pET-30b(+)为载体,分别构建重组质粒pF0643和pF0862,在大肠杆菌BL21(CE3)中诱导表达并纯化Slr0643及Sll0862蛋白,以β-酪蛋白为底物检测重组蛋白的酶活性。【结果】体外酶活实验显示重组表达的Slr0643及Sll0862蛋白有内切蛋白酶活性,且其活性受金属螯合剂o-phenanthroline的抑制。体外酶活的鉴定结果为进一步研究Slr0643和Sll0862的体内酶活和生物学功能奠定了基础。【结论】集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862具有金属蛋白酶活性。     

集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白基因sll0862缺失突变株对热胁迫与氧化胁迫的响应

原核生物中S2P参与应答外界环境刺激,然而行光合作用的蓝细菌-集胞藻PCC6803的S2P同源蛋白功能未知。【目的】考察集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白sll0862是否参与外界环境刺激的应答。【方法】监测在高温和氧化胁迫的条件下sll0862基因缺失突变株与野生株在生长速率或存活率上的差异,利用水样调制叶绿素荧光仪(water-PAM,脉冲-振幅-调制叶绿素荧光仪)测量在高温和氧化胁迫的条件下突变株与野生株叶绿素荧光参数的差异,来考察其光合作用差异。【结果】sll0862突变株与野生株在正常的培养环境中生长速率并无差异,但是将sll0862突变株与野生株在48℃加热处理半小时后,sll0862突变株的存活率明显低于野生株。当初始OD730值为0.1的藻液中添加终浓度为1 mmol/L双氧水的时候,sll0862突变株的生长速率比野生株明显低,而且氧化胁迫条件下突变株与野生株的调制叶绿素荧光有差异。【结论】集胞藻PCC6803中sll0862基因的缺失导致突变体对高温与氧化胁迫响应出现缺陷,提示有功能的sll0862参与响应热和氧化胁迫。研究结果为进一步阐述S2P同源蛋白sll0862在集胞藻PCC6803中的功能奠定基础。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。     

阻断集胞藻6803 PHB合成途径提高胞内NADPH含量

蓝藻是探索利用太阳能生产化学品的重要微生物,但产量低限制了蓝藻化学品的工业应用。提高宿主还原力水平是提高微生物合成化学品产量的重要手段。为提高集胞藻细胞内NADPH含量,利用同源重组方法,获得敲除聚羟基丁酸酯PHB合酶编码基因phaC和phaE的集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803突变体S.DphaC&E。PCR结果证明突变体S.DphaC&E基因组中phaC和phaE已完全被氯霉素抗性基因取代。生长曲线结果显示S.DphaC&E的生长与野生型无明显差异,说明敲除phaC和phaE对     

FASN基因的原核表达及生物信息学分析

脂肪酸合成酶(FASN)在生物体内起着重要的作用,主要参与恶性肿瘤的数量调控。本研究旨在构建pET28a-FASN原核表达载体,并表达重组His-FASN蛋白,对该基因进行结构与功能的生物信息学分析。设计FASN基因特异性引物,通过PCR扩增获得的目的基因与原核表达载体pET28a连接,经IPTG诱导表达His-FASN蛋白。获得基因片段大小为1 320 bp,编码440个氨基酸;成功构建至pET28a原核表达载体,通过优化表达,确定在温度为35℃、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间为6 h的条件下融合蛋白表达量较高,获得蛋白大小约为53 kD;生物信息学分析结果表明FASN基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,不存在信号肽及跨膜区,可成为蛋白激酶磷酸化位点有12个Ser、5个Thr、3个Tyr。此外,从蛋白相互作用网络中发现,相互作用的蛋白包括主要酰基辅酶A合成酶长链家族成员及乙酰辅酶A羧化酶家族成员,为开发抑制剂药物提供了理论依据。     

耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB信号肽与β-FFase融合表达质粒pET22b-pelB-bff,将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白,采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒pET22b-pelB-bff,通过优化诱导表达条件,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度30 °C,诱导时间10 h,比活力高达108 U/mg,实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达,纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙,0.1 mol/L HEPES pH 6.7,26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1 ?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究,为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系,定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。     

集胞藻PCC6803膜脂循环关键基因酶学性质和生理功能

集胞藻PCC6803野生型和其脂酰ACP合酶敲除突变株的自由脂肪酸含量和组成表明膜脂的重构和降解是细胞内自由脂肪酸的来源之一。在这一过程中脂肪酶起到关键性作用。通过基因组数据库检索,发现集胞藻PCC6803基因组中只有一个脂肪酶编码基因sll1969,但是还没有其功能相关的生化证据。为了确定该基因的功能及其在脂肪酸代谢途径中的作用,加深对集胞藻PCC6803脂肪酸代谢途径的了解,文中将sll1969基因在大肠杆菌中过表达和体外纯化,得到重组蛋白Sll1969,并对其酶学性质进行初步分析。在30℃条件下,测得Sll1969以对硝基苯丁酸酯作为底物时的Km和kcat值分别为(1.16±0.01)mmol/L和(332.8±10.0)/min;该脂肪酶的最适反应温度为55℃。通过比较分析sll1969突变株中脂肪酸含量和组成变化,发现sll1969的表达量与细胞自由脂肪酸的产量呈正相关,但Sll1969不是细胞中唯一的脂肪酶。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Synechocystis Fe superoxide dismutase gene confers oxidative stress tolerance to Escherichia coli

The superoxide dismutase (SOD) gene (slr 1516) from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 was cloned and overexpressed in Escherichia coli BL 21 (DE3) using the pET-20b(+) expression vector. E. coli cells transformed with pET-SOD overexpressed the protein in cytosol, upon induction by isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The recombinant protein was purified to near homogeneity by gel filtration and ion-exchange chromatography. The SOD activity of the recombinant protein was sensitive to hydrogen peroxide and sodium azide, confirming it to be FeSOD. The pET-FeSOD transformed E. coli showed significantly higher SOD activity and tolerance to paraquat-mediated growth inhibition compared to the empty vector transformed cells. Based on these results it is suggested that overexpression of FeSOD gene from a heterologous source like Synechocystis sp. PCC 6803 may provide protection to E. coli against superoxide radical-mediated oxidative stress mediated by paraquat.     

集胞藻PCC6803铜离子诱导表达平台的构建

在集胞藻PCC6803中,基因敲除是研究基因功能的最直接有效的方法,但是对于某些生存必需的基因则无法通过这种方法获得突变株。为研究集胞藻PCC6803中此类基因的功能,在其基因组中构建了一个petE基因启动子（PpetE）控制的铜离子诱导表达的平台。将集胞藻PpetE装配在lacZ报告基因的上游,通过同源双交换整合到这种蓝藻的基因组中。通过调节培养基中铜离子的浓度发现,lacZ的表达能够人为控制。特别是当铜离子浓度在6－400nmoL／L范围时,LacZ活力随铜离子浓度增加呈S型增长关系。利用这个铜离子诱导表达平台,可以控制某些必需基因的表达：提供铜离子维持细胞生存;而撤去铜离子时则关闭基因的表达,可以观察其对生命活动的影响。     

小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

Enhanced poly-beta-hydroxybutyrate accumulation in a unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803

AIM: To stimulate poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) accumulation in Synechocystis sp. PCC 6803 by manipulating culture conditions. METHODS AND RESULTS: Stationary phase cultures of Synechocystis sp. PCC 6803 were subjected to N- and P-deficiency, chemoheterotrophy and limitations of gas-exchange. Enhanced PHB accumulation was observed under all the above conditions. However, interaction of P-deficiency with gas-exchange limitation (GEL) in the presence of exogenous carbon boosted PHB accumulation maximally. CONCLUSIONS: Combined effects of P-deficiency and GEL boosted PHB accumulation up to 38% (w/w) of dry cell weight (dcw) in Synechocystis sp. PCC 6803 in the presence of fructose and acetate. This value is about eightfold higher as compared with the accumulation under photoautotrophic growth condition. SIGNIFICANCE AND IMPORTANCE OF THE STUDY: These results showed a good potential of Synechocystis sp. PCC 6803 in accumulating poly-beta-hydroxybutyrate, an appropriate raw material for biodegradable and biocompatible plastic. Poly-beta-hydroxybutyrate could be an important material for plastic and pharmaceutical industries.