SAPl8和Sufu蛋白质复合物的表达纯化研究

通过分子克隆技术将Sufu和SAP18构建到原核载体,在原核表达系统进行外源表达,采用亲和层析和分子筛层析对Sufu和SAPl8及其复合物进行纯化。同时利用非变性胶的方法进一步确定该蛋白之间的相互作用及结合比例。结果表明,原核表达系统中Sufu和SAPl8蛋白表达量高,可以纯化到高纯度的蛋白质。su如和SAPl8结合的摩尔比为1：1,按摩尔比1：2混合、纯化可以得到高纯度、稳定的蛋白复合物,从而为进一步复合物的结构生物学研究奠定基础。     

人类mTOR信号通路Ragulator复合物的各亚基的原核表达与纯化

Ragulator是mTOR信号通路中的一个关键蛋白复合物,分别由p18、p14、MP1、Lamtor4、Lamtor5五个蛋白通过相互作用复合而成。Ragulator在mTOR通路中起到结合Rag GTPases并锚定到溶酶体表面的作用,而后者招募并激活mTORC1。本研究通过生物信息学和分子克隆相结合的手段,构建各组分蛋白全长的质粒以及截短p18(41~161)和Lamtor(83~173)片段,相应转化到大肠杆菌中进行蛋白的表达。使用Ni~(2+)柱亲和层析,阴离子交换层析和快速蛋白液相色谱相结合的蛋白纯化手段得到纯度较高的稳定的Ragulator复合物,为后续的晶体制备和生物学结构奠定了基础。同时也为进一步深入了解该信号通路的机制以及相关药物的开发与研究作出了贡献。     

DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain, SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL) T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白...     

稳定表达TSC1／TSC2蛋白质复合物的293T细胞系的建立

我们使用Clonetech的同源重组酶连接人TSC1、TSC2全长蛋白编码eDNA0RF到pBudCE4．1真核细胞双元表达载体上,用脂质体Lipofectamine2000介导重组质粒pBudCE4．1／TSC2／TSC1导入293T细胞,用含125μg／mLzeocin的培养基筛选稳定表达TSC1/TSC2蛋白的细胞株,并用Westemblot方法鉴定稳转细胞株的稳定性。该实验成功建立了稳定表达TSC1／TSC2蛋白的293T细胞系,从而为今后研究TSC1／TSC2蛋白的结构与功能提供实验基础。     

PDZ结构域的结构特点及其识别特异性配体的机制

PDZ结构域作为介导蛋白质之间相互作用的重要结构域之一,参与到细胞内运输、离子通道、以及各种信号传导通路等多种生物学过程.PDZ结构域是由80~100个氨基酸组成的小的球状结构域,对某些多PDZ结构域蛋白来说,需要一前一后形成串联体才能正确折叠.另外,PDZ结构域相互之间也可以形成同源或异源二聚体.这些PDZ结构域的突出特点是能特异性地识别配体靶蛋白C末端短的氨基酸序列,但有些也能识别靶蛋白的内部β发夹结构.而一些支架蛋白的PDZ结构域与细胞膜上脂类的相互作用则增加了其与膜的亲和性.本文简要概括了PDZ结构域的结构特点及其对配体的各种特异性识别的机制,从而为研究各种PDZ蛋白的功能提供了结构基础.     

6-羟基烟酸3-单加氧酶Ni cC的纯化与结晶

【背景】含氮杂环吡啶化合物是重要的环境污染物之一,在人体内长期积累会导致肿瘤/畸胎等疾病,利用微生物降解含氮杂环化合物是一种非常有效的途径。【目的】在大肠杆菌中克隆表达6-羟基烟酸3-单加氧酶基因nic C,纯化重组Nic C蛋白并进行结晶条件的研究。【方法】以恶臭假单胞菌KT2440为模板对nicC基因进行PCR扩增,构建重组表达载体p ET28a-nic C,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对NicC蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】成功构建重组质粒p ET28a-nic C并纯化获得达到结晶纯度的NicC蛋白。通过结晶条件初筛和正交优化实验发现,NicC蛋白的最佳结晶条件为:0.2mol/LNH_4Cl,0.01mol/LCaCl_2·2H_2O,31%PEG4000,0.05mol/LTris-HClp H8.0,4°C;Se Met-NicC蛋白和NicC与6-HNA共晶的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L CaCl_2·2H_2O,0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9,31%PEG3350,4°C。【结论】NicC蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究为最终解析NicC蛋白三维结构提供了有利条件,为揭示吡啶环β位单加氧酶识别含吡啶环底物并催化底物的吡啶环上β位羟基化的分子机理奠定了基础。     

mTORC1通路中氨基酸信号转导相关机制研究进展

雷帕霉素靶点蛋白（target of rapamycin,TOR）作为细胞内重要的生长和代谢调节中枢,主要通过形成两种复合物TORC1与TORC2发挥其功能。其中TORC1接收广泛的细胞内信号,如氨基酸水平、生长因子、能量以及缺氧状态等,通过调控蛋白质合成来促进细胞的增殖与生长。在这些信号当中,氨基酸不仅能够激活TORC1通路,还同时作为其他信号激活TORC1的必需条件。目前,对于生长因子和能量水平激活TORC1过程的分子机制已有较深入的认识,而对于氨基酸信号如何转导至TORC1的分子机制直到近年来才有了新的突破。该文通过梳理已发表的哺乳动物细胞中氨基酸信号调控mTORC1分子机制的相关实验结论,对该领域的研究方向进行了总结和展望。     

SAP18和Sufu蛋白质复合物的表达纯化研究

通过分子克隆技术将Sufu和SAP18构建到原核载体,在原核表达系统进行外源表达,采用亲和层析和分子筛层析对Sufu和SAP18及其复合物进行纯化。同时利用非变性胶的方法进一步确定该蛋白之间的相互作用及结合比例。结果表明,原核表达系统中Sufu和SAP18蛋白表达量高,可以纯化到高纯度的蛋白质。Sufu和SAP18结合的摩尔比为1:1,按摩尔比1:2混合、纯化可以得到高纯度、稳定的蛋白复合物,从而为进一步复合物的结构生物学研究奠定基础。     

早期开髓减压引流术联合氢氧化钙对牙髓炎患者咀嚼功能及血清CD14、HIF-1α、CX3CL1水平的影响

摘要 目的：探讨氢氧化钙联合早期开髓减压引流术对牙髓炎患者血清白细胞分化抗原-14 （CD14）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、CX3C趋化因子配体1（CX3CL1）水平和咀嚼功能的影响。方法：选取2020年1月~2022年4月期间徐州医科大学附属连云港医院收治的174例牙髓炎患者,按照双色球法将患者分为对照组、研究组,各为87例。两组均接受早期开髓减压引流术,对照组使用氧化锌丁香酚水门汀填充,研究组使用氢氧化钙糊剂填充。观察两组疗效、疼痛视觉模拟评分（VAS）、咬合力、咀嚼效率、CD14、HIF-1α、CX3CL1水平。结果：与对照组相比,研究组的临床总有效率进一步升高（P<0.05）。与对照组相比,研究组治疗7 d后VAS评分降低,咬合力增加,咀嚼效率提高, 血清CD14、HIF-1α、CX3CL1水平降低（P<0.05）。结论：牙髓炎早期开髓减压引流术后采用氢氧化钙填充治疗,可有效减轻患者疼痛,改善咀嚼功能,提升咬合力,调节血清CD14、HIF-1α、CX3CL1水平,提高临床治疗效果。     

抑制型Smad对TGF-β信号通路的负调控研究进展

转化生长因子TGF-β超家族是一类在结构上相关的蛋白,目前发现在哺乳动物中有超过30多个细胞因子可能属于这一超家族。它们在各类细胞中广泛参与细胞生长、黏附、迁移、分化及凋亡等过程。其中抑制型Smad(I-Smads,包括Smad6和Smad7)是TGF-β/BMP信号通路里重要的抑制型蛋白,在多种细胞与组织的发育过程以及疾病的发生过程中扮演着重要的角色。对其研究已经过10多年,取得许多重大的进展,但也还有很多重要的问题还没有解决。着重介绍I-Smads对TGF-β信号通路的负调控研究进展。