放射受体法测定表皮生长因子

介绍用大鼠肝细胞膜为材料 EGF 放射受体分析方法. ¹²⁵I-EGF 采用 Iodogen 方法,其标记率为50%左右, ¹²⁵I-EGF 对受体的结合率为20—30%.大鼠肝细胞膜 EGF放射受体法的灵敏度为 28pg/管,精密度为6.3%.应用此法测定了大鼠血清,颌下腺和唾液中的 EGF 的含量.     

重组人粒细胞集落刺激因子Cdna在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED－GCSF和pEF－GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO－dhfr－细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED－GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×10⁴pg/ml和2.3×10⁵pg/ml,pEF－GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×10⁵pg/ml和1.4×10⁵pg/ml。转染CHO－dhfr－细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO－dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG－CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG－CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG－CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。     

固相时间分辨荧光免疫螯合剂 BCPDA 的制备及其标记技术

报道了固相时间分辨荧光免疫螫合剂4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸(BCPDA)的制备方法,BCPDA 标记蛋白质及螫合 Eu³⁺方法,BCPDA-Eu³⁺标记物荧光光谱研究以及固相时间分辨荧光免疫分析法检测甲胎蛋白异质体(AFP-R-LCA)方法的建立.结果表明 BCPDA 能在温合条件下与蛋白质氨基结合并与 Eu³⁺螯合,BCPDA-Eu³⁺蛋白质标记物荧光特性、标记比度、生物结合活性与国外同类产品一致,所建立的检测 AFP-R-LCA 免疫分析法最小检测值0.6ng/ml,为提高我国非放射性同位素标记技术水平奠定了基础.     

125Ⅰ标记乙型肝炎病毒DNA探针的制备及应用

本文报道用国产¹²⁵I-碘化钠标记乙型肝炎病毒DNA制备探针,可得到较高比度的产物,一般稳定在10⁷—10⁸cpm/μg DNA。用该探针对不标记的乙型肝炎病毒DNA进行点分子杂交。可检测到5pg左右DNA。对17例血液标本进行点分子杂交,结果与32p-标记乙型肝炎病毒DNA探针杂交结果基本一致。     

高灵敏、高特异性心钠素放射免疫测定方法及应用

本法应用戊二醛连结α-人心钠素(α-hANF)和牛血清白蛋白,产生的复合物免疫家兔,获得抗α-hANF血清,其最终效价为1:35万,亲和常数K_a=4.94×10^-10mol/L。α-hANF应用氯胺-T氧化法进行 ¹²⁵I标记,再经DEAE-SephadexA25柱层析纯化,得到单碘 ¹²⁵I-α-hANF,比放射性为300μci/μg左右。最小检出量为1.8pg/管。与8种肽交叉反应为:α-rANF 98％、心房肽Ⅲ 40％,其它6种无交叉反应。样品变异系数,批内:4.4％,批间:16.3％。     

抗体包被瘤细胞膜引发人血多形核白细胞化学发光

用抗体包被K562细胞膜碎片(Ab-M)刺激人血多形核白细胞(PMN)产生化学发光,对其发光动力学及活性氧代谢特征进行了比较,结果表明Ab-M引发PMN发光动力学与酵母多糖不同.用秋水仙碱干扰PMN膜结构完整性可抑制其发光产额,Ca²⁺可促增PMN发光,提示PMN氧代谢的调控与Fc受体和Ca²⁺动员有关;活性氧系PMN实施细胞毒效应的重要物质.     

过氧亚硝基-鲁米诺化学发光体系的改进

建立了一个测定过氧亚硝基阴离子（ONOO^－）化学发光的改进体系,测试了某些抗氧化剂清除ONOO^－的作用,其体系的组成和启动发光的程序如下：向pH 10.5碳酸缓冲液配的0.01 mol/L浓度NaN₃溶液通O₃ 30 s,取其800 μl原位注入含有100 μl水配样品和100 μl的0.001 mol/L鲁米诺溶液中,启动化学发光（chemiluminescence, CL）,立即测定每6秒的脉冲数（CP6S）,连续测定10～30次.根据实际需要,选其某一次的CL强度作为评判指标,对比抗氧化剂的活性.该发光体系灵敏、简便、且较稳定,最低可检测限为8.74 μmol/L的ONOO^－量,线性范围为8.74～74.04 μmol/L.批内变异系数3.35%（n=10）,批间变异系数5.52%（n=10）.测得维生素C(Vit.C)、茶多酚（EGCG）、原花菁素、硫脲皆有抑制CL,即清除ONOO^－的作用.     

铕标记抗癌胚抗原单克隆抗体C17的研究和应用

用合成的N′-(对-异硫氰基苄基)-二乙三胺-N¹,N²,N³,N³-四乙酸铕钠为螫合剂.用Sephadex G-50凝胶柱层析分离标记C₁₇和过量试剂.分部收集的层析物的光密度图和荧光强度图完全一致.蛋白峰处两管标记C₁₇的比活性分别为5.2和8.9Eu³⁺离子每C₁₇分子,而且C₁₇的标记回收率为64%.标记C₁₇至少在6个月内是稳定的.用铕标记物得到的时间分辨免疫荧光分析的标准曲线具有良好线性和斜率,表明标记物免疫活性良好,而且已用于血清CEA分析.     

色氨酸类似物标记法研究DsbA蛋白的结构环境

用生物标记的方法将色氨酸类似物标记在DsbA蛋白中的色氨酸位置,分析标记蛋白质的谱学性质、色氨酸结构环境和潜在应用前景.5-OH-Trp标记的DsbA蛋白具有315 nm激发的荧光发射光谱;¹⁹F-NMR 能分辨5-F-Trp标记的DsbA蛋白的两个F-Trp残基(Trp76和Trp126),Trp76化学位移变化反映二硫键交换引起的结构转化.进一步将利用标记蛋白的独特荧光和¹⁹F-NMR性质,研究DsbA蛋白的氧化还原及与底物蛋白的结合作用.     

人表皮生长因子受体在大肠杆菌菌膜上功能性表达

为将人表皮生长因子(EGF)受体膜外第Ⅲ功能区(hEGF-RⅢ)表达于大肠杆菌菌膜上,重组构建了EGF-RⅢ表达载体,并转化获得大肠杆菌表达株.放射性受体分析发现¹²⁵I-EGF可与表达菌特异性结合,其特异性结合量随反应的时间和温度而变化,Scatchard分析显示表达菌表达单一亲和性受体,其解离常数为3.0×10^-11 mol/L,每个细菌约有738个结合位点.免疫电镜显示EGF-RⅢ多分布于细菌菌膜上.     

基于裸磁珠体系检测血清淀粉样蛋白A浓度方法的建立与效果评估

传统链霉亲和素磁珠体系及酶促发光体系中通常存在生物素干扰强、发光率低、特异性差的缺陷。基于此，以裸磁珠为载体偶联血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A, SAA）抗体，以吖啶酯作为发光标记物，依据双抗夹心原理，建立了一种快速测定SAA的方法，并对该方法的检测性能（包括：空白限、检测限、线性范围、精密度验证、干扰试验、HOOK效应、方法学比较等）进行了评估。结果表明，SAA抗体与裸磁珠成功偶联；该方法空白限为0.6 mg·mL^-1，检出限为1.0 mg·mL^-1；线性范围为1~100 mg·mL^-1 （R²＞0.990）；在精密度方面，以CV表示的重复性、室内精密度均<10%；血红蛋白、胆红素、甘油三酯对临床样本的干扰检测结果相对偏差均<10%。Bland-Altman偏倚分析表明，该方法检测值与西门子试剂的测量值差异基本在95％CI的一致性界限内波动，回归分析结果显示有较好的相关性（R²=0.987）。上述结果表明，研究所建立的裸磁珠-吖啶酯发光检测体系性能参数可满足临床检测要求，适用于血清中SAA的快速检测。     

3.0 T磁共振扩散加权成像在乳腺良恶性病变鉴别中的价值及较优b值下ADC值与预后因子相关性研究

摘要 目的：研究3.0 T磁共振扩散加权成像在乳腺良恶性病变鉴别中的价值及较优b值下ADC值与预后因子的相关性。方法：选取2017年11月～2019年11月于我院接受诊治的乳腺病变患者50例进行研究,将其按照良恶性差异分成恶性组40例与良性组10例,另取同期于我院体检的健康志愿者50例作为对照组。对所有人员均进行3.0 T磁共振扩散加权成像,比较不同b值下ADC值在不同乳腺组织中的差异,比较不同b值下诊断乳腺良恶性病变的效能,分析较优b值下ADC值和乳腺癌患者各项预后因子的相关性。结果：对照组、良性组、恶性组在不同b值下的ADC值均呈逐渐降低趋势（P＜0.05）;对照组、良性组、恶性组b值为1000 s/mm²下的ADC值均低于b值为600 s/mm²（P＜0.05）。b值为1000 s/mm²时诊断乳腺恶性病变的敏感度、特异度、准确度分别为92.50%、100.00%、94.00%,高于b值为600 s/mm²的70.00%、60.00%、68.00%（P＜0.05）。b值为1000 s/mm²下雌激素受体、孕激素受阳性患者的ADC值低于阴性患者,而人类表皮生长因子受体2阳性患者的ADC值高于阴性患者（P＜0.05）。经Spearman相关性分析可得,b值为1000 s/mm²下ADC值与雌激素受体、孕激素受体阳性表达均呈负相关关系,而与人类表皮生长因子受体2阳性表达呈正相关关系（P＜0.05）。结论：3.0 T磁共振扩散加权成像在乳腺良恶性病变鉴别中的价值较高,且以b值为1000 s/mm²的诊断能效较优。此外,b值下ADC值和乳腺癌部分预后因子表达状态密切相关。     

定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性。方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等。结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1%BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min。批内、批间变异系数分别为2.16%~9.23%和2.29%~11.71%,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962。结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。     

hs-CRP、VEGF、CEA联合检测在鉴别良、恶性胸腹腔积液中的临床价值

目的:探讨hs-CRP(high-sensitivity CRP,超敏CRP)、VEGF(Vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)、CEA(癌胚抗原)对胸腹腔积液鉴别诊断的临床价值.方法:应用乳胶增强散射比浊法、EILSA方法及电化学发光免疫分析技术,检测81例患者胸腹腔积液中hs-CRP、VEGF和CEA的浓度.结果:恶性胸腹腔积液组hs-CRP浓度为[(10.03±10.86)mg/l]与良性胸腹腔积液组[(3.24±4.56)mg/l]比较,差异非常显著(P<0.01);恶性胸腹腔积液组VEGF浓度为[(321.41±295.91)pg/ml]与良性胸腹腔积液组[(31.00±92.87)pg/ml]比较,差异非常显著(P<0.01);恶性胸腹腔积液组CEA浓度为[(227.46±738.08)ng/ml]与良性胸腹腔积液组[(1.10±1.12)ng/ml]比较,浓度明显高于良性组(P<0,05);hs-CRP、VEGF和CEA恶性胸腹腔积液中检测的敏感性分别为47%、58%和47%、特异性为57%、96%和98%;在区分良恶性胸腹腔积液时,hs-CRP、VEGF和CEA联合检测优于单项检测.结论:恶性胸腹腔积液组中hs-CRP、VEGF和CEA水平明显高于良性组.hs-CRP、VEGF及CEA联合检测可区分良、恶性胸腹腔积液的性质,其中以VEGF及CEA联合检测为最佳,对于良、恶性胸腹腔积液的鉴别诊断具有较高的临床价值.     

γ-干扰素时间分辨免疫荧光分析方法的建立

采用生物素-Eu³⁺标记链亲和素双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析技术(TRIFMA),建立新的γ-干扰素检测技术,提高γ-干扰素检测方法的灵敏度.用固相包被的兔多抗捕获样品中IFN-γ,以具有中和IFN-γ抗病毒活性的生物素化单抗作为二抗体,再加Eu³⁺标记链亲和素并荧光检测.已知不同浓度标准IFN-γ CPS值的标准曲线,判断待检样品中IFN-γ量.本方法最低检测值为0.02 μg/L,检测范围为0.02～400 μg/L,而TNF-α,IL-2和IFN-α等细胞因子无交叉反应.对基因工程IFN-γ的生产,纯化过程中定性, 定量监控以及对培养细胞上清中IFN-γ量的检测等都有实用价值.     

中间锦鸡儿叶表皮微形态的经度格局及其影响因素

环境因子是影响植物种内变异的主要因素,而叶片是植物体最易受环境影响的器官。为了探究中间锦鸡儿植物叶表皮微形态是否具有经度变异及其影响因素,该研究在内蒙古高原调查了8个中间锦鸡儿种群叶片的气孔密度、气孔指数、表皮毛密度、气孔器长、气孔器宽,并利用回归分析探究其变异程度以及影响因子。结果表明：(1)锦鸡儿上下表皮均被有单细胞非腺毛,角质层粗糙,气孔下陷,为抗旱特征;中间锦鸡儿上表皮气孔密度、气孔指数、表皮毛密度、气孔器长和气孔器宽的均值分别为302.81个/mm²、9.94、204.81个/mm²、11.78 μm和5.95 μm,而叶片下表皮分别为272.83个/mm²、10.43、187.45 个/mm²、12.49 μm和6.18 μm。(2)中间锦鸡儿叶片的气孔密度与气孔指数随经度的增加而增加,而表皮毛密度随经度的增加却减小。(3)叶片上下表皮的可塑性指数排序均为：表皮毛密度>气孔密度>气孔指数>气孔器宽>气孔器长;中间锦鸡儿的叶表皮主要通过调节表皮毛密度及气孔密度来响应环境的变化,环境因子中日照时数、有效积温、相对湿度、土壤全碳、全磷、全氮含量显著影响叶片表皮的微形态特征。     

基于亲和素-生物素双夹心体系测定外源性蛋白血清动态浓度的非抗体依赖新方法

建立一种非抗体依赖的检测外源性蛋白多肽分子代谢动力学血清浓度及动态变化的新方法．链亲和素为捕获分子,加入待测生物素标记蛋白或合成肽,辣根过氧化物酶标记链亲和素为检测分子,构成链亲和素-生物素标记大分子-酶链亲和素的双夹心体系,并进行特异性、敏感性、准确性及稳定性评价．本检测体系灵敏度高,可达0.3125 μg/L,且可通过改变亲和素包被浓度调整检出敏感度与检测范围．准确性回收率为97.82%～107.92%,批内、批间变异系数分别< 5.76% 和< 8.42%,并成功应用在生物素标记人血清白蛋白(biotin-HSA)与生物素标记鸡卵黏蛋白(biotin-OVM)的小鼠血清浓度动态检测．本方法不依赖抗体与放射性核素,可望在外源性蛋白多肽大分子及其药物的体内定量检测和代谢动力学研究中广泛应用．     

生物素-链霉亲和素免疫学法测定地高辛的研究

采用国产链霉亲和素直接包被塑料板孔,生物素标记抗体,建立的竞争酶联免疫吸附试验的方法测定血中地高辛浓度.其测定灵敏度为0.0964 μg/L,最低检测限为0.2251 μg/L,测定三份低、中、高浓度的血清标本,批内变异系数为8.9%,5.9%,2.4%;批间变异系数为15.8%,10.1%,9.2%,测定回收率在89.1%～107.22%之间,此法与FPIA方法相关良好(r=0.9488).     

抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的构建和表达

构建和表达抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体,并测定该微型双功能抗体的生物学活性。 采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用免疫荧光法、放射免疫分析法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。DNA序列测定结果表明：抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达2mg/L以上,纯化产物中二聚体的比例达90%,具有与Jurkat（CD3⁺）和K562/A02细胞（Pgp⁺）结合的活性,与抗CD3 ScFv及抗Pgp ScFv的亲合常数相当。成功地构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体,并获得高效表达,表达产物具有与相应二个靶抗原结合的活性。     

CA19-9时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

本研究旨在建立一种定量检测血清中CA19-9含量的时间分辨荧光免疫层析检测方法。采用双抗体夹心法与荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球和NC膜为载体将CA19-9配对抗体进行标记和包被,制备CA19-9检测试纸条。通过标记、包被抗体量对工艺进行优化,并通过线性范围、最低检出限、精密性等性能指标对CA19-9时间分辨荧光层析检测方法进行评价。最终确定20μL荧光微球的标记抗体量为80μg,检测线包被抗体浓度为1.5 mg/mL时,检测时间为15 min,线性范围为12.5–800 U/mL,最低检出限为6.32 U/mL,批内精密性与批间精密性均小于15%,平均回收率为101%,与罗氏电化学发光检测试剂盒平行检测50份临床样本,两者相关系数为0.980 6。初步建立了定量检测血清中CA19-9的荧光免疫层析检测方法,有较好的临床应用前景。