Characterization of VAMP-2 gene from marine teleostean, Lateolabrax japonicus

The whole length SPV2 gene of 715 bp, encoding VAMP-2 protein of 110 amino acids from Japanese sea perch, Lateolabrax japonicus, was obtained by using both RT-PCR and anchored PCR strategies while we initiated the structural and functional study on SNARE proteins in marine teleostean. Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that SPV2 has its core arginine residue, a potential N-linked glycosylation site near its N-terminal, and one transmembrane domain in its C-terminal. Advanced structural analysis of bioinformatics approach predicts a coiled-coil α-helix backbone as the characteristic of SPV2 main conformational structure, identical to the structure of rat VAMP-2 obtained by crystallography. Semi-quantitative RT-PCR revealed that SPV2 was generally expressed in 10 neural and non-neural tissues, with the highest concentration in brain and the least in muscle.     

水稻bZIP蛋白REB结合Wx基因启动子中的GCN4基序

在水稻Wx基因启动子中找到了一个由胚乳基序(EM)和GCN4基序组成的双元胚乳盒. 许多文献报道,种子贮存蛋白基因启动子中的胚乳盒与基因的种子专一性表达有关,一类bZIP家族的转录因子通过结合胚乳盒中的GCN4基序而调控相应基因在种子中专一性表达.本文证明了水稻Wx基因启动子的胚乳盒中的GCN4基序能被水稻未成熟种子中的核蛋白识别并结合.进一步采用PCR的方法克隆了水稻bZIP家族的转录因子——REB的部分cDNA,并在E.coli中表达了REB融合蛋白.凝胶滞后试验结果表明,除文献报道,REB能结合α-globulin启动子上的靶位点外,REB也能识别并结合水稻Wx基因启动子的GCN4基序.     

苜蓿中华根瘤菌Sm NifA蛋白与阴沟肠杆菌Ec NifA蛋白功能差异的研究

nifA基因是固氮基因nif的调节基因, 其产物NifA蛋白是固氮过程的中心调节因子. 将多拷贝组成型表达的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti, Sm) nifA基因或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, Ec) nifA基因引入苜蓿中华根瘤菌野生型菌株Sm1021和苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY中, 并检测这些苜蓿中华根瘤菌感染苜蓿之后根瘤的表型及固氮酶活性. 实验结果表明, 苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白和阴沟肠杆菌NifA蛋白在苜蓿中华根瘤菌中的功能有明显差异. 在野生型菌株Sm1021中, 引入多拷贝Sm nifA基因对宿主根瘤固氮效率的促进作用明显优于引入多拷贝Ec nifA基因的作用. 引入多拷贝Sm nifA基因的SmY菌株(nifA突变型)能够共生固氮, 而引入Ec nifA基因的SmY菌株仍然不能固氮. 氨基酸序列同源性分析显示, N末端结构域是Sm NifA蛋白和Ec NifA蛋白同源性最低的功能域. 进一步研究表明, Sm NifA蛋白的N末端结构域在互补苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY的固氮功能时是必需的.     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和611,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611,转化到大肠杆菌M15,经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。     

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和GUS基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因cryIA(b)和cryIA(c)导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中,然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选,获得一批Bt转基因株。经PCR、Southern杂交及Western印迹分析证实此二基因已整合进水稻中,饲虫试验结果表明,转基因株具有100%杀虫率。     

疟蚊Anopheles gambiae和A. arabiensis嗅觉结合蛋白基因的鉴定和表达谱分型

嗅觉在疟蚊寄主发现行为过程中起主要作用. 基于生物信息学技术, 对按蚊嗅觉结合蛋白基因进行了全基因组分析, 结果总共鉴定了32条嗅觉结合蛋白(OBP)候选基因序列. 进一步采用半定量反转录聚合酶链反应(semi-quantitative RT-PCR), 以疟蚊激动蛋白基因为内部表达参照标准, 研究了冈比亚按蚊所有嗅觉结合蛋白候选基因的组织特异性表达谱. 结果显示: 其中20个OBP候选基因在嗅觉组织(雌蚊触角)中有强的表达, 这说明OBP在疟蚊嗅觉行为中起重要作用. 还研究了冈比亚按蚊复合体(A. gambiae complex)中两种最重要的疟蚊, 即冈比亚按蚊(A. gambiae)和阿拉伯按蚊(A. arabiensis)的蚊种嗅觉特异性表达型, 结果发现其中12个OBP候选基因显示种间差异表达, 同时发现阿拉伯按蚊触角中OBP的累积相对表达强度高于冈比亚按蚊, 其比例为1441.45︰1314.12. 这可能是由二者的不同寄主偏好行为所致, 因为冈比亚按蚊高度嗜吸人血, 而阿拉伯按蚊则介于嗜吸人血和嗜畜血之间, 因此后者需要表达更多的OBPs以支持其寄主选择行为模式. 疟蚊OBP基因的鉴定及其组织和蚊种特异性表达型的确定, 是分析疟蚊嗅觉探测的分子机制的第一步, 如嗅觉结合蛋白重组表达及其配体鉴定.     

带cry3Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

N-乙酰高丝氨酸内酯（N-cyl-homoserine lactones,AHLs）,是一类数量感知（Quorum-sensing）系统中的信号分子,它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白能降解这类AHLs分子,进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子,它相对于其它cry类基因的启动子有启动基因转录时间早,转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR,用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换编码AiiA蛋白的基因aiiA自身的启动子,构建了融合基因pro3A-aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT304的BamHI/SphI位点,得到重组质粒pBMB686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株BMB686的AiiA蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株,对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力也明显优于对照菌株。     

番茄LeHsp110/ClpB基因的分子克隆及其对植物耐热性的影响

HSP100/ClpB是Clp蛋白家族的一员,具有分子伴侣功能,与细胞“获得耐热性(acquired thermotolerance)"相关。从番茄cDNA文库中筛选到长度达3144 bp的cDNA,依据最长的开放读码框推导出的多肽含980个氨基酸残基,分子进化分析结果表明该蛋白属于HSP100/ClpB家族,因其计算分子量为110 kD,所以命名为LeHSP110/ClpB。实验证明,LeHsp110/ClpB在番茄叶片中没有组成型表达,为热诱导型基因,其编码蛋白定位于叶绿体基质。利用农杆菌介导法,将CaMV35S驱动的反义LeHsp110/ClpB cDNA片段导入番茄,高温下转反义基因的番茄株系中LeHsp110/ClpB mRNA水平明显低于对照,转基因株系的PSⅡ对高温胁迫更加敏感,说明HSP110/ClpB在植物耐热性方面起重要作用。     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 1000多个转化子依次在含不同G₄₁₈浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 24～ 28h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7.5 ,菌体密度OD₆₀₀ =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 160mg/L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 ,为大批量制备奠定了基础.     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR 克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHAR dehydroascorbate reductase 基因的 cDNA 与 DNA 全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导 PCR 的染色体步行技术（genome walking）克隆了其上游 644bp 的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长 1486bp,存在两个内含子,DNA 编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明：BoDHAR与同源基因AT1G195701cDNA 序列有 82.3% 的一致性,推导的氨基酸序列有 79.6% 的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明：BoDHAR 在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

羽衣甘蓝胁迫应答基因BoRS1转化烟草的初步研究

将克隆于羽衣甘蓝的胁迫应答基因BoRS<、I>1连入中间载体p35S 2 30 0 ::gus ::noster相应位点,成功地构建了含BoRS1基因的植物双元表达载体p35S 2 30 0 ::BoRS1::noster,并通过农杆菌介导法对烟草进行了遗传转化。PCR检测结果表明目的基因BoRS1已成功地导入并整合到烟草基因组中。RT PCR分析显示,在不同的转基因烟草植株中BoRS1表达量存在差异。转BoRS1烟草的耐干性和甘露醇胁迫研究表明,BoRS1基因的表达对提高植物抗干旱胁迫能力有一定的作用。     

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 ,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

急性T淋巴细胞白血病原癌基因Lmo2的一种全新剪接模式

Lmo2是隶属于LIM蛋白家族的一个T细胞白血病原癌基因,研究显示,它与胚胎卵黄囊期红系发育、成体血细胞分化相关,并且在血管新生过程中发挥着重要的作用.先前的工作显示该基因编码一个158氨基酸的蛋白质,含有2个串联的特征性LIM 结构域,但对于其转录调控方式尚缺乏系统的研究.为进一步了解Lmo2转录水平的表达调控机制,以正常成人肾组织mRNA为材料,结合SMART PCR及5′RACE技术找到了Lmo2基因的一种新的剪接模式.这个新的转录本只含有2个外显子,编码一个151氨基酸的蛋白质.有趣的是,这个蛋白质与LMO2蛋白具有相同的可读框,只是N端7个氨基酸序列不同.将含有转录起始点上游294核苷酸至下游180核苷酸的基因组片段插入报道基因载体并转染COS7细胞系,显示出稳定的启动子活性.对各种不同来源的组织、细胞系进行RT-PCR检测,发现此种剪接模式以不同丰度广泛存在. 关键词     

斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501反硝化相关基因结构及功能分析

在A1501株的基因组上鉴定了4个反硝化相关的基因簇: nar, nir, nor和nos, 共40个基因, 基因的转录产物与其他种群中物质运输、基因调控以及还原酶类蛋白高度同源. nir, nor和nos基因簇在染色体上位置靠近, 与nar基因簇相隔较远. 与其他反硝化细菌比对的结果表明, A1501株中的40个反硝化基因组成了一套完整的反硝化催化系统. 在A1501株中, 该系统有以下特点: (ⅰ) nar基因簇中, narK基因只发现一个拷贝. (ⅱ) 在narK与narG之间有一个narM基因. (ⅲ) 在narX, narL基因的下游鉴定了两个基因dnrE和orf1, 其中dnrE基因是一个属于FNR家族的转录因子. (ⅳ) A1501株中nir基因有16个, 是所有已知反硝化细菌nir基因数量最多的. (ⅴ) 在A1501株中, 同时也是在假单胞杆菌属中首次报道norR基因. (ⅵ) nos基因簇相对保守, 无论在基因组成还是排列方式与参照的菌株都完全一致.     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶基因cefEF的克隆及序列分析

利用氯化苄分别从真菌顶头孢(Cephalosporium acremonium)和产黄头孢(Acremonium chrysogenum)中提取总DNA,通过PCR方法扩增脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶基因cefEF,结果只能从产黄头孢DNA中扩增出cefEF基因。测序结果表明,其与已报道的基因序列只有3个碱基的差异,推断的氨基酸序列只有2个氨基酸有差异,并未涉及活性中心。同时表明,国外所指的与该酶有关的顶头孢(Cephalosporium acremonium或Acremonium chrysogenum)对应的是国内的产黄头孢(Acremonium chrysogenum)。     

水稻Osgrp-2基因的结构、表达特性和染色体定位

富含甘氨酸的蛋白质(GRP)是植物细胞壁的一种重要结构蛋白, GRP基因的表达具有组织特异性, 受发育阶段和多种环境因素的调控, 因此GRP基因为植物基因的表达调控研究提供了一个良好的模式. 从水稻基因组文库中克隆了一个新的GRP基因Osgrp-2, 测定了其序列, 并通过5′RACE实验确定了该基因的转录起始位点, 从而界定了约2.4 kb的启动子序列. 还详细分析了Osgrp-2在水稻中的时空表达特性和损伤诱导表达特性. 最后, 将Osgrp-2定位于水稻的第10号染色体上.