双重实时逆转录PCR检测G2、G3型轮状病毒方法的建立

目的建立一种双重实时逆转录PCR,用于G2、G3型轮状病毒的快速检测和定量分析。方法采用G2、G3型轮状病毒VP7基因特异性引物/探针和体外转录RNAs,建立双重实时逆转录PCR,在同一反应管中同时检测G2、G3型轮状病毒VP7基因;并对该方法的灵敏度、重复性、有效性进行验证。结果双重实时逆转录PCR标准曲线R~2>0.99,扩增效率在90%～110%之间。灵敏度可达10~1拷贝,不同浓度体外转录RNAs重复性检测CV均≤4.18%。单重和双重实时逆转录PCR均可以对G2、G3型单价样本和混合样本进行有效检测,试验内CV均≤2.08%,试验间CV均≤2.52%。单重和双重实时逆转录PCR检测同一样本时具有良好的一致性,检测结果之间差异无统计学意义(P>0.05),两种方法相关性较好(R~2>0.95)。结论本方法特异、快速、灵敏且重复性好,可以在同一反应管中同时检测两种目的基因,缩短了检测周期,降低了检测成本和污染风险,为轮状病毒的分型和定量提供了更为快速、有效的检测方法。     

一种通用的基于NSP5基因的A组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

建立一种通用的检测不同物种来源A组轮状病毒的逆转录实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)。根据轮状病毒保守的NSP5基因的保守序列设计引物和探针,建立并优化RT-qPCR检测体系;同时通过9份轮状病毒毒株和96份临床标本的检测对该方法和目前常用的基于NSP3基因的2种RT-qPCR方法进行灵敏度和检出率的比较。新建立的RT-qPCR方法特异性高,重复性好;与基于NSP3基因的方法相比:(1)在临床标本检测中,检出率无差异;(2)9株培养病毒检测中,NSP5体系可全部检出,两个NSP3对照体系NSP3-1和NSP3-2的检出率分别为78.78%(7/9)和88.89%(8/9);(3)NSP5体系与对照NSP3-1体系灵敏度相当,检测下限比NSP3-2体系低100倍。本研究建立的基于NSP5的荧光定量PCR体系灵敏度高,可检测毒株范围广,为检测不同物种来源的A组轮状病毒提供一种新的选择。     

婴幼儿腹泻A群轮状病毒G和P的基因分型研究

目的研究浙江萧山医院婴幼儿童腹泻标本中人轮状病毒（Human Rotavims）毒株的感染情况及G和P基因型流行特点。方法收集该院2009年8月至2010年8月腹泻儿童15233份粪便标本采用酶联免疫吸附试验、逆转录-巢式聚合酶链反应进行轮状病毒病原检测,将128份阳性标本进行VP7和VP4基本分型。结果15233份婴幼儿腹泻标本中有2706份标本为轮状病毒阳性,阳性率17．8％;男孩和女孩检出率差异无统计学意义,以6-12月龄段检出率最高;对128份阳性标本进行G血清分型和P基因分型,G1型53份（41．4％）、G3型38份（29．7％）、G1G3型17份（13．3％）、G未分型20份（15．6％）;P[8]型72份（56．3％）、P[4]型16份（12．5％）、P[8]P[4]型3份（2．3％）、P未分型37份（28．9％）,G血清型和P基因型的组合以G1P[8]为主,占29．7％（38／128）。结论浙江萧山医院A群轮状病毒G血清以G1型为主,其次为G3型,P基因型以P[8]型为主。     

南京地区2012～2013年G9型轮状病毒VP7基因特征的分析

A组轮状病毒是引起成人和婴幼儿急性腹泻的主要病原。了解轮状病毒流行株的型别,对主要中和抗原VP7的编码基因进行遗传变异分析,可为当地轮状病毒疫苗的应用和开发提供指导。我们对2012年10月至2013年12月南京地区908例腹泻门诊患者的粪便标本进行轮状病毒检测,采用RT-PCR方法对随机抽取的50份阳性标本进行G分型,并对其中19份G9型轮状病毒的VP7基因序列测序分析。结果发现轮状病毒阳性率11.34%(103/908),其中以G9型为主,占78.0%(39/50),其次是G2、G1和G3型。对G9型轮状病毒VP7基因核苷酸序列进行分析,显示主要分为G9-VI亚型和G9-III亚型,以G9-VI亚型为主,且属于中国和日本G9型轮状病毒亚簇,部分毒株在A、B、C、F四个中和抗原表位中有变异,这可能有助于G9型轮状病毒的流行,值得引起注意。     

表达轮状病毒G2和G3型vp7基因重组腺病毒的免疫效果

为探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价轮状病毒(Rotavirus,RV)基因工程疫苗的可行性,在前期工作的基础上,对表达我国G2和G3型RV流行毒株vp7基因的重组腺病毒的免疫效果进行了研究。分别用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒rvAdG2VP7、rvAdG3VP7经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体、黏膜抗体和相关的细胞因子水平进行了检测和比较。结果表明,用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠后,均可诱导机体产生较强的RV特异性免疫反应,包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,并能产生中和抗体。但免疫反应以Th2类为主,Th1类反应也占有相当的比例。本研究为新型RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础。     

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。     

基于VP6和VP7基因猪轮状病毒RT-PCR检测方法的建立与比较

为建立并比较不同靶基因猪轮状病毒(Po RV)快速检测方法,针对Po RV VP6和VP7基因设计2对RT-PCR特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度,分别建立了Po RV VP6基因和VP7基因RT-PCR快速方法,并对其特异性与2种方法检测差异性进行检测分析。结果显示,2种RT-PCR方法最适退火温度为53℃,以VP6基因建立的RT-PCR最适引物浓度为8μmol/L,以VP7基因建立的RT-PCR最适引物浓度为4滋mol/L。2种方法均具有良好的特异性,对临床102份样品进行检测,二者阳性检出率无差异性(p0.05)。表明所建2种RT-PCR方法均可应用于Po RV快速检测,以期为贵州省猪轮状病毒病的综合防控提供理论依据。     

以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R~2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。     

寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、厄尼诺洛峡谷病毒(El Moro Canyon virus,ELMCV)以及岛景病毒(Isla Vista virus,ISLAV)四种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术,本研究选用上述四种病毒的N蛋白基因作为靶标区域设计四组特异性引物探针,建立四重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用四种病毒体外转录RNA进行灵敏度和重复性验证,并使用其他病毒细胞培养物及体外转录RNA进行特异性验证。结果显示,四重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到95%以上,四种病毒体外转录RNA灵敏度介于1～10拷贝/μL,与单重检测方法无明显差异,且与其他病毒无交叉反应。稳定性评价结果显示,批内、批间变异系数均在3%以内。本研究所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于相关样本的诊断与筛查。     

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。     

轮状病毒LLR株VP7抗原表位的预测与验证

在GenBank中检索A组轮状病毒不同血清型的VP7基因信息,在氨基酸水平上与G10血清型LLR株的VP7序列进行序列对比,分析其血清型特异的氨基酸保守序列位点。结合蛋白质二级结构预测理论方案,设计合成3条具有轮状病毒G10血清型特异性氨基酸序列的多肽。通过检测合成肽对轮状病毒免疫血清与LLR抗原的结合抑制,证实三条多肽均具备了LLR表位属性。     

血清E型沙眼衣原体的Real-time PCR定量分析

目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。     

北京腹泻儿童中G9-Ⅵ轮状病毒再次出现并呈优势流行

1994年从北京腹泻儿童中鉴定的国内首例G9型A组轮状病毒(Group A Rotavirus,RVA)株T203属于G9-Ⅵ(VP7基因进化树支Ⅵ),而之后国内流行的G9型RVAs主要属于全球广泛流行的G9-Ⅲ(VP7基因进化树支Ⅲ)。本研究于2010年通过基因测序从北京腹泻儿童中再次鉴定了一例RVA G9-Ⅵ。为了解北京儿童中G9-Ⅵ再次流行的情况,本研究对国内外人G9型RVAs的VP7基因进行多序列比对分析,在G9-Ⅲ和G9-Ⅵ病毒各自VP7基因序列比较保守、彼此间变异集中的区域设计杂交探针,经PCR合成地高辛标记的cDNA探针,建立区分G9-Ⅲ和G9-Ⅵ的斑点杂交方法;结合本实验室前期建立的RVA常见G和P基因型杂交鉴定方法,对2011-2012年门诊腹泻就诊患儿中RVAs的流行进行调查。结果显示G9型检出率最高(43.5%,57/131),其次是G3(30.5%)、G1(12.2%)和G2(11.5%),未发现G4型。P分型结果显示P[8]为主要基因型(85.2%),其次P[4]型(14.8%),未发现P[6]型。对57例G9型RVAs全部进行G9-Ⅲ和G9-Ⅵ杂交鉴定。结果显示:G9-Ⅵ占96.5%,取代G9-Ⅲ(3.5%)成为优势流行的G9型病毒。从VP7基因进化树图上看到,本研究鉴定的北京人RVA G9-Ⅵ同国内外近期多地出现的人RVA G9-Ⅵ进化关系密切,并且和加拿大的猪RVA株F7P4进化距离近。国内外新近重新出现的人G9-Ⅵ RVAs是否在进化过程中获得了比以往广泛流行的RVA G9-Ⅲ更强的传播能力或致病力,值得进一步研究。     

实时荧光定量PCR 检测人肿瘤细胞NKG2D 配体基因表达

目的:建立人肿瘤细胞NKG2D配体基因(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表达的实时荧光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR)检测方法。方法:根据NCBI基因库中NKG2D配体基因序列,设计合成引物。用Trizol法从培养的肿瘤细胞(BEC-7402、HeLa、MDA-MB-435、XWLC-05)中提取总RNA,逆转录成cDNA,建立实时荧光定量PCR检测NKG2D配体基因表达的方法,并检测NKG2D配体在肿瘤细胞株中的表达。结果:经过琼脂糖凝胶电泳、熔解曲线和标准曲线分析,用所设计的引物和SYBR Green I能够特异扩增和定量检测NKG2D配体基因的表达。该方法成功检测4种肿瘤细胞NKG2D配体基因的表达。结论:建立了人NKG2D配体基因表达的实时荧光定量PCR检测方法,为进一步研究人NKG2D配体在肿瘤免疫中的作用提供了有效手段。     

大熊猫轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了能对大熊猫轮状病毒的早期感染和隐性感染大熊猫做出有效诊断,并为病毒定量分析提供技术支持。本研究根据 GenBank中登录的大熊猫轮状病毒（GPRV）VP4基因序列设计1对引物,建立一种快速准确的检测大熊猫轮状病毒的荧光定量 RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度和循环数进行优化,同时建立标准曲线,并将建立的荧光定量方法与常规RT-PCR方法比较。结果显示,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,比常规 RT-PCR灵敏度高出至少100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的重复性。研究结果表明该方法可以对大熊猫轮状病毒进行稳定、可靠的检测,可以满足大熊猫轮状病毒特性研究和感染诊断的需要。