应用基因芯片快速检测分枝杆菌

目的:将临床疑似分枝杆菌感染患者的标本用基因芯片方法进行分枝杆菌菌种鉴定,并将基因芯片检测的结果与传统的抗酸染色方法进行对比。方法:采用基因芯片PCR扩增、分子杂交、微阵列芯片扫描的方法检测379例临床疑似标本。结果:基因芯片阳性检出率为16.3%(62/379),涂片抗酸染色法阳性检出率为15.3%(58/379),两者差异无统计学意义(χ2=0.16,P>0.05);62例基因芯片检测阳性患者中有52例为结核分枝杆菌,另有10例为非结核分枝杆菌(其中3例偶然分枝杆菌,1例龟/脓肿分枝杆菌,1例堪萨斯分枝杆菌,4例浅黄分枝杆菌,1例海分枝杆菌)。结论:结合临床病例分析结果显示,基因芯片检测对鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分型具有快速、特异性高的特点,在分枝杆菌感染的早期诊断和治疗上具有重要的临床价值,值得推广和应用。     

应用专一性寡核苷酸微阵列可靠地检测结核分枝杆菌利福平耐药性

DNA微阵列代表聚合酶链反应产物诊断测序的发展方向 .根据结核分枝杆菌rpoB基因利福平抗药性决定区域内点突变及其它重排的特征 .研制一种快速地鉴定结核分枝杆菌利福平耐药菌株的中等密度微阵列方法 .利福平抗药性通过使荧光标记扩增遗传物质与微阵列杂交测定 .检测5 3株利福平耐药结核分枝杆菌和 15株利福平敏感结核分枝杆菌 .微阵列方法的检测结果与药物敏感性试验和DNA测序结果完全一致 .临床标本PCR扩增后仅 1 5h可检出利福平耐药临床分离株 .表明寡核苷酸微阵列是高效的、专一性的方法 ,可作为检测利福平抗药性的快速方法以弥补传统培养方法的不足     

3种检测分枝杆菌方法的比较及应用价值分析

目的:比较并评价涂片抗酸染色法(涂片法)、L-J培养法和基因芯片法在分枝杆菌检测中的应用价值。方法:对241例需查抗酸杆菌的临床标本,采用涂片法、L-J培养法和基因芯片法检测分枝杆菌,3种方法检测结果存在分歧的标本再进行DNA测序,以培养鉴定结果阳性或DNA测序得到分枝杆菌序列为确诊标准。结果:241例标本,涂片法、L-J培养法和基因芯片法的检测阳性率依次为18.7%、12.0%、15.8%,经卡方检验三者阳性率的差异没有统计学意义(P0.05);检测灵敏度依次为85.4%、70.7%、93.0%,经卡方检验三种方法的灵敏度总体来说有差别(χ2=7.24,P0.05),涂片法与L-J培养法以及涂片法与基因芯片法的灵敏度差异没有统计学差异,基因芯片法的灵敏度高于涂片法(χ2=6.61,P0.05);检测特异性依次为95.6%、100.0%、100.0%。38例基因芯片检测阳性患者中有28例为结核分枝杆菌,10例为非结核分枝杆菌。结论:与涂片法及培养法相比较,基因芯片法能够鉴别分枝杆菌菌种,同时具有快速、可靠、准确度高的特点,在分枝杆菌感染的早期诊断和抗菌治疗上具有重要的临床价值。     

宏基因组学二代测序技术在感染性呼吸系统疾病病原体诊断中的应用进展

呼吸系统感染发病率高,早期明确感染的病原体是提高治愈率、降低死亡率的关键。目前病原体培养仍是临床病原学诊断的主要方式,但其敏感性低、耗时较长,不利于早期诊断和治疗。宏基因组学测序技术具有覆盖病原体广泛、快速、无偏倚、无需特异性扩增的优势,在鉴定罕见、混合感染、免疫抑制患者感染和常规检测方法难以检测到病原体的诊断中有较高的临床应用价值;但其也有特异性较低、公认判读标准缺乏、测序结果与治疗关系不明确、耐药基因检测困难、价格较高等不足。在临床应用中,宏基因组学测序与传统微生物检测技术具有相互补充的作用,两者结合使用能够提高临床诊断效能。本文就近年来宏基因组学测序方法在临床的应用进展进行综述。     

应用多重PCR方法检测石蜡包埋组织标本中的分枝杆菌DNA

应用多重PCR方法检测并鉴别石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌复合体与非结核分枝杆菌DNA扩增片段类型 ,为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法。应用三对具有特异性的寡核苷酸引物 ,进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌 6 5kD表面抗原、结核分枝杆菌插入序列IS6 1 1 0及人类β 珠蛋白基因的部分序列 ,其扩增产物分别为 3 83bp、1 2 3bp和 2 6 8bp。此种多重PCR方法检测的灵敏度为 0 6pg。经多重PCR扩增后进行凝胶电泳 ,结核分枝杆菌复合体 (结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、BCG)均可见 3 83bp、1 2 3bp片段 ,而非结核分枝杆菌 (鸟、龟、瘰疬、蟾蜍、堪萨斯、胞内、耻垢分枝杆菌 )仅见 3 83bp片段 (猿猴分枝杆菌与结核分枝杆菌复合体相同 )。与上述相比 ,分枝杆菌感染的临床标本分别增加了一条 2 6 8bp片段。对 2 0 9例临床初步诊断为淋巴结结核病人的石蜡包埋组织标本进行了多重PCR检测 ,1 93例病理诊断为淋巴结结核、结核性肉芽组织、结核性肉芽肿性炎症病人的标本 ,检测结果符合结核分枝杆菌复合体感…     

采用分子生物学技术诊断隐球菌脑膜脑炎的研究

目的采用分子检测技术对疑似隐球菌感染的脑膜炎病例进行诊断。方法收集患者的脑脊液样本,提取DNA,设计引物进行PCR扩增,采用DNA芯片技术对扩增产物进行分子检测。结果显示样本新生隐球菌阳性。结论通过ITS保守序列设计引物进行PCR扩增和DNA芯片技术对常规真菌学检查不能确定的疑似隐球菌脑膜炎患者脑脊液样本进行非培养检测,具有实验室诊断参考价值。     

联合使用放射检测和核酸探针方法快速检出和鉴定致病性分枝杆菌

<正>由于与AIDS病流行有关的结核分枝杆菌和复合鸟型分枝杆菌感染的发病率骤然增加以及市政收容所中无家可归人群中结核病的大量发生,放射检测和探钟技术在分枝杆菌实验室中的应用恰好适应了这种势头。出于临床和流行病学的考虑,快速诊断和迅速投入治疗在这两类病人中是极端重要的。 最先描述分枝杆菌的放射检测技术是在1971年。使用含确~(14)C标记的棕榈酸盐液体培养基自动检出痰液中分枝杆菌报导于1977年,使用BACTEC放射检测方法从临床标本中快速检由分枝杆菌,通过大量研究已经证实。 近年来,DNA杂交技术己应用于分枝杆菌的检测与鉴定,包括特异性探针对结核分枝杆菌,鸟型分枝杆菌和细胞内分枝杆菌培养物的鉴定。 本研究讨论了两个大医院的实验室对不同病人联合使用放射检测和DNA探针分析,以求迅速检出和鉴定分枝杆菌。     

鲟分枝杆菌病及其病原研究

20092010年间,我国人工养殖的中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrencki）和杂交鲟（hybrid sturgeon:A. baeri-A. gueldenstaedtii）暴发了细菌性疾病。患病鲟通过组织切片观察,病原菌的分离、鉴定以及组织样品中病原菌的检测,结果显示从19条患病鲟中分离到49株分枝杆菌。病原菌经过多个保守基因的测序分析和部分生理生化特征的鉴定,共发现有7种分枝杆菌,分别为龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）、戈登氏分枝杆菌（Mycobacterium gordonae）、偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）、苏尔加分枝杆菌（Mycobacterium szulgai）、猪分枝杆菌 （Mycobacterium porcinum）和Mycobacterium arpuense。在诊断过程中发现两种或三种分枝杆菌同时存在于同一样品中,分子生物学的诊断结果表明分枝杆菌复合感染十分常见,而海分枝杆菌是分枝杆菌复合感染中最为常见的分枝杆菌。分离的病原菌对斑马鱼的攻毒试验结果表明在以上7种分枝杆菌中海分枝杆菌的毒力最强。以上结果表明海分枝杆菌是鲟分枝杆菌病的主要致病菌,分枝杆菌复合感染是鲟分枝杆菌病的主要感染形式。研究中史氏鲟和中华鲟的分枝杆菌病,以及在病鱼体内分离的猪分枝杆菌和M. arupense在国内外均尚未见报道。       

用基因表达谱芯片研究中医经脉-脏腑相关的机理

基因芯片(Genechip),又称DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray),包括寡核苷酸微阵列(Oligo-microarray)及DNAmicroarray,是生物芯片(biochip)中应用最广泛、技术最成熟的分支。一般可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片。现就基因表达谱芯片在中医经脉脏腑相关研究中应用思路及前景作一探讨。     

哺乳动物转录因子DNA结合谱

基因差异表达是生物发育和对刺激作出应答的分子基础,转录因子在这种基因差异表达中发挥着重要的调控作用。因此,要弄清楚转录因子调控基因差异表达的机理,就必须鉴定出它们全部的靶基因并构建其操纵的转录调控网络。对基因组DNA的序列特异性结合是转录因子调控基因转录的关键环节,因此,要鉴定转录因子的靶基因,就必须从它们与DNA相互作用的分子水平,鉴定它们能够识别并结合的全部DNA序列,即转录因子DNA结合谱。近年来随着DNA微阵列芯片和高通量DNA测序技术的产生和快速发展,出现了建立转录因子体内及体外DNA结合谱的一系列革命性的新技术,对该领域的研究带来重大影响。这些新技术主要包括建立转录因子体内DNA结合谱的染色质免疫沉淀-芯片技术(ChIP-chip)和染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-Seq),以及建立转录因子体外DNA结合谱的双链DNA微阵列芯片技术(dsDNA microarray)、指数富集配体系统进化-系列分析基因表达技术(SELEX-SAGE)、结合-n-测序技术(Bind-n-Seq)、多重大规模并行SELEX技术(MMP-SELEX)、凝胶迁移实验-测序技术(EMSA-Seq)和高通量测序-荧光配体互作图谱分析技术(HiTS-FLIP)。文章将对这些新技术做一综述。     

恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者诊断中的应用

目的评价恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者下呼吸道感染病原体检测中的效果。方法收集合格痰标本146例,通过恒温扩增芯片法和细菌培养法检测病原体,对两种方法检测结果进行分析。结果 146例痰液标本中,恒温扩增芯片法检出阳性标本114例(阳性率为78.1%),其中单一致病菌感染42例,2种及以上致病菌混合感染72例。45例标本检测到mecA基因,其中13例为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。146例痰标本中,有109例痰标本同时进行了痰培养检测,痰培养阳性率为67.9%(74/109),相应的恒温扩增芯片法检测阳性率为82.6%(90/109);痰培养结果阴性共计35例,与之相符合的恒温扩增芯片法检测阴性共计16例(阴性符合率45.7%)。恒温扩增芯片法对肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌的阳性检出率明显高于痰培养,差异具有统计学意义。恒温扩增芯片法检测到2例结核分枝杆菌复合群、1例军团菌、1例肺炎支原体,痰培养检测到3例奇异变形杆菌。结论本实验室所开展的恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染者下呼吸道病原体检测方面的优势体现在阳性率高、检测时间短,可为临床肺部感染诊断提供及时准确的参考依据。     

建立液相芯片方法检测鉴别结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌与副结核分枝杆菌

运用液相芯片技术原理,以分枝杆菌菌种(群)特异基因序列IS6110、IS1081、IS1245和F57为目标基因,设计筛选4套扩增引物和杂交探针,建立同时检测鉴别结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌的四重液相基因芯片检测方法。对13种共54株分枝杆菌菌株以及23种常见微生物样品的检测结果显示,四重液相芯片方法可特异检测鉴别目标菌种(群),与其它分枝杆菌菌种或微生物无非特异交叉反应;检测敏感性达2.1×101-2.5×102基因拷贝或0.06-0.74 fg DNA;组内检测变异系数和组间检测变异系数均<10%。采用四重液相芯片方法从临床结核疑似人痰样和牛组织样品中检出结核致病菌,检出率分别达75.6%(99/131)和94.9%(37/39),显著高于培养法(38.9%和53.8%)。对副结核疑似临床样品的检测试验结果显示,四重液相芯片方法与荧光PCR方法的阳性符合率为83%(24/29)。对四重混合模板的检测试验结果显示该液相芯片方法可鉴别不同菌种混合感染。四重液相芯片方法的检测周期<1 d,其中对纯化DNA模板的检测时间可在2-3 h内完成。     

转化医学真菌学实例——直接提取DNA鉴定菌种及体外药敏试验指导诊治面部难辨认癣

目的报道1例由万博节皮菌(趾间毛癣菌有性期)所致面部难辨认癣,取皮损鳞屑直接提取真菌DNA做菌种鉴定,并与真菌培养鉴定结果比较,对培养的菌落直接用抗真菌乳膏做药敏实验指导治疗。方法病变部鳞屑经KOH涂片真菌镜检阳性后,取鳞屑直接提取DNA,以真菌通用引物ITS1/4做PCR扩增后测序;同时从培养生长的菌提取DNA做分子生物学鉴定;并将抗真菌乳膏加入含菌平板孔中观察抑菌圈大小。结果鳞屑直接提取的DNA与培养获得菌落提取的DNA经PCR-测序均鉴定为万博节皮菌,诊断万博节皮菌感染所致面部难辨认癣。镜检阳性后即给予特比萘芬口服(250mg/d)及1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏外用,每周复诊并取鳞屑镜检和培养,基于药物抑菌实验结果指导治疗5周,至临床治愈和真菌培养转阴。结论鳞屑直接提取DNA做PCR-测序能及早明确菌种,待培养菌落长出后做PCR-测序验证,直接用成品抗真菌乳膏做体外药敏实验指导临床选药,动态培养鳞屑以确定疗程。此个体化诊治方案为从临床到实验室、从实验室到临床转化医学真菌学的成功实例。     

真菌感染的实验室诊断研究进展

随着易感人群逐渐增多,对临床真菌感染标本的快速检测及真菌培养的分离鉴定日益重要。所幸目前有新的检测方法用来辅助早期诊断及指导经验性的抗真菌治疗。主要的进展集中在对标本的真菌抗原直接检测方面(如半乳甘露聚糖和β-葡聚糖);假丝酵母产色培养基等快速培养鉴定法;微生物生化自动分析系统(VITEK2)和显微扫描(MicroScan)等生化自动检测平板;多肽核苷酸原位杂交,特异性的大范围聚合酶链反应(PCR)检测以及针对临床标本或培养阳性标本直接DNA测序技术。     

2018—2020年平顶山地区非结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性分析

本文旨在观察2018—2020年河南省平顶山地区非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)的菌种分布及耐药情况。收集2018年1月—2020年12月平顶山市传染病医院分离到的326株NTM,采用DNA微阵列芯片鉴定菌种,改良罗氏培养基比例法进行药敏试验。结果显示,从61～80岁患者中分离的NTM菌株最多,其次是41～60岁患者。共鉴定出8个NTM菌种,分别为胞内分枝杆菌(35.28%)、龟/脓肿分枝杆菌(24.85%)、鸟分枝杆菌(18.40%)、偶然分枝杆菌(5.21%)、戈登分枝杆菌(1.23%)、堪萨斯分枝杆菌(12.58%)、浅黄分枝杆菌(1.53%)、瘰疬分枝杆菌(0.92%)。NTM对异烟肼的耐药率最高,为97.85%。除戈登分枝杆菌外,其他NTM菌种对异烟肼的耐药率均＞94%;胞内分枝杆菌对丙硫异烟胺的耐药率(8.70%)相对较低,鸟分枝杆菌对丙硫异烟胺的耐药率为10.00%;龟/脓肿分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、阿米卡星的耐药率均＞95%;偶然分枝杆菌对左氧氟沙星的耐药率为35.29%,堪萨斯分枝杆菌对左氧氟沙星的耐药率最低(7.32%);戈登分枝杆菌对异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、对氨基水杨酸的耐药率均≥50%;浅黄分枝杆菌对乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素的耐药率均＜50%;瘰疬分枝杆菌对阿米卡星和丙硫异烟胺的耐药率为0。结果提示,2018—2020年河南省平顶山地区鉴定出的8个NTM菌种中,胞内分枝杆菌占比最高,不同菌种对不同抗结核药物的耐药性差异较大,因此菌种鉴定对临床治疗有重要意义。     

新生隐球菌感染12例临床特点及实验室检测的回顾性分析

目的:了解新生隐球菌深部感染的临床特点及实验室检测,分析其耐药性.方法:对12例新生隐球菌感染患者的临床资料进行网顾性分析;应用美国BD9240全自动血液分析仪进行细菌培养和真菌培养,阳性酵母样真菌经API20C鉴定到种;FUNGS 3进行真菌药敏试验.结果:12例患者均经病原学确诊;其中中枢神经系统感染6例,血液感染5例,腹腔感染1例;新生隐球菌对临床常用5种抗真菌药物除2例氟康唑中介外,其余均敏感.结论:新生隐球菌不仅引起中枢神经系统感染,也可引起身体多部位感染,死亡率较高;早期病原学检测对疾病的诊断和治疗十分重要,联合用药预后较好.     

一种基于寡核苷酸微阵列芯片的多重可扩增探针杂交技术

多重可扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization,MAPH)是近年来发展起来的一种用于基因组中DNA拷贝数检测的新技术。并发展了一种基于寡核苷酸微阵列芯片的MAPH技术。该方法根据所检测的DNA序列,制备若干具有通用引物的FCR产物作为可扩增探针组,与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针,经生物素标记的通用引物扩增后,与相应的寡核苷酸微阵列芯片杂交。该特异性的寡核苷酸微阵列芯片包括10个抗肌营养不良基因的外显子探针和阴性、阳性探针。杂交清冼后,链霉亲和素-Cy3染色用芯片扫描仪得到杂交的荧光图像。分析荧光信号的强度差异给出特定基因片段拷贝数的变化。该方法用微阵列技术代替MAPH中的电泳检测技术,可大幅度增加检测的通量。选择了一个正常男性、一个正常女性和一个肌营养不良症患者的基因组DNA来进行验证。结果表明,该方法能够同时给出抗肌营养不良基因多个外显子中的基因片段拷贝数差异信息。     

新型Taq Man-MGB探针在结核分枝杆菌实时PCR检测中的应用

为建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的结核分枝杆菌DNA定性定量检测方法 ,以TaqMan探针技术为基础 ,运用TaqMan MGB探针 ,实时检测临床标本中的结核分枝杆菌DNA .用来自临床标本的DNA及克隆于载体的IS6 1 1 0序列检测所建立方法的有效性 .结果显示 ,所建立方法的最低检测限度为 1个基因拷贝 反应 ,在每反应 1 0 0 ～ 1 0 8拷贝范围内 ,Ct 值同DNA量的对数呈线性关系 .同一模板不同时间或同一时间不同管内扩增 ,所得Ct 值恒定 .用该方法检测 37例结核分枝杆菌培养阳性的痰液标本 ,敏感度为 1 0 0 % ;用该方法检测 1 6例TB系列阴性参考品 ,特异性为1 0 0 % .结果表明 ,所建立的方法是用于结核分枝杆菌定性定量检测较理想的方法     

一种基于新型再测序芯片的不明原因呼吸道感染样品检测方法的建立

再测序芯片(Resequencing Pathogen Microarray,RPM)是一种新的基于微阵列DNA芯片的病原体检测与鉴定技术。为了将RPM应用于不明原因呼吸道感染的检测,提高应对传染病暴发的能力,本研究建立了基于一种新型RPM的呼吸道多病原检测方法。该方法可以同时检测19种常见呼吸道病毒、9种甲型流感(Flu A)和11种鼻病毒(HRV)、28种肠病毒、18种少见呼吸道病毒。选取已验证的16种常见呼吸道病毒感染阳性的样本评价RPM的特异性,用克隆质粒或体外转录的RNA梯度稀释液来检验RPM的灵敏度,在10～103拷贝/反应水平时RPM仍能检测和分辨出相近的病毒亚型。将8份不明原因的咽拭子样品提取的核酸合并,用新建立的方法进行检测,根据RPM结果再以普通PCR加测序作为验证,同时和Abbott公司的质谱测序(PLEX-ID)结果进行比较,除RPM检出假阳性PIV1外,三者的其余检测结果一致。结果表明,这种基于新型RPM的方法具有高灵敏度、高通量的优点,对应对新发和突发传染病具有重要意义。     

红色毛癣菌致脓癣1例

目的报告1例由红色毛癣菌引起的脓癣,通过病发分子鉴定明确病原菌,早期诊断并进行经验性治疗。方法提取病发及脓液中的真菌DNA,进行ITS区扩增、测序和比对;同时,对病发和脓液进行真菌镜检及培养,对培养阳性菌落进行形态学、分子生物学鉴定以及体外药敏检测。结果病发和脓液DNA提取及ITS区鉴定提示红色毛癣菌;真菌镜检阴性;真菌培养经形态学和分子生物学鉴定提示红色毛癣菌。体外药物敏感性检测显示其对特比萘芬高度敏感。诊断为红色毛癣菌所致头癣,予口服特比萘芬125 mg/d,治疗1个月后明显改善。结论直接提取病变组织DNA进行早期分子诊断能够能尽早明确致病菌种并指导用药。