乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)检测程序的方法学性能评价

目的对本实验室乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)定量检测程序方法学性能进行评价,以了解其方法学性能是否符合临床及本实验室检测要求。方法分别取高浓度(HP)和低浓度(LP)两个水平的患者标本对精密度进行评价,取国家标准品(L1-L6)对正确度、线性范围及检测下限进行评价。结果高浓度(HP)和低浓度(LP)两个水平的患者标本CV均低于5.0%,精密度符合要求;L1-L6检测结果均在国家标准品的允许范围内,正确度符合要求;a=0.9867,r2=0.9985,线性范围符合要求;国家标准品中的L4稀释后,300IU/mL、500IU/mL均可检出,符合试剂盒的检测灵敏度要求。结论本室所评价的试剂盒方法学性能指标均符合要求,适合在本室开展。     

乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）检测程序的方法学性能评价

摘 要：目的 对本实验室乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量检测程序方法学性能进行评价,以了解其方法学性能是否符合临床及本实验室检测要求。方法 分别取高浓度(HP)和低浓度(LP)两个水平的患者标本对精密度进行评价,取国家标准品（L1-L6）对正确度、线性范围及检测下限进行评价。结果 高浓度(HP)和低浓度(LP)两个水平的患者标本CV均低于5.0%,精密度符合要求;L1-L6检测结果均在国家标准品的允许范围内,正确度符合要求;a=0.9867,r2=0.9985,线性范围符合要求;国家标准品中的L4稀释后,300 IU/mL、500 IU/mL均可检出,符合试剂盒的检测灵敏度要求。结论 本室所评价的试剂盒方法学性能指标均符合要求,适合在本室开展。     

幽门螺杆菌cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃部特定的病原菌,感染呈全球分布,感染率高达50%以上。现已证实它是轻度胃炎,消化性溃疡及胃癌的主要病因。Ⅰ型H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该片段只出现于致病相关菌株,基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,TFSS),通过转运相关毒素而参与H.pylori诱导上皮细胞细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NF-κB、诱导促炎细胞因子白细胞介素-8的表达等,故在H.pylori的致病中起着关键作用。近年来,研究者们致力于研究Ⅳ型分泌系统的功能,但是对于这个装置是如何转运蛋白进入宿主细胞的确切机制还是知之甚少,因此,对Ⅳ型分泌系统的研究将有助于进一步明确H.pylori致病机制,并为临床诊断和治疗提供新的靶点。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagT基因的克隆表达及其重组蛋白对SGC-7901细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响

[目的]初步研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637 cagT(HP0532)基因对SGC-7901细胞增殖和白细胞介素-8(IL-8)分泌的影响.[方法]应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cagT编码基因片段,将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆.测序分析确认后,IPTG诱导表达,表达蛋白以Ni2 -NTA柱进行纯化,并经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-8,并用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.[结果]成功克隆了cagT基因,全长843bp(GenBank 登录号为 EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%～99%.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为32kDa,经Ni2 -NTA柱纯化后可获得纯度为98%重组蛋白.经透析复性后的蛋白(终浓度10μg/mL)作用于SGC-7901细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达.不同浓度CagT蛋白与SGC-7901细胞作用,细胞增殖的程度随着蛋白浓度的增加逐渐降低,细胞的增殖受到抑制.[结论]CagT蛋白可刺激SGC-7901细胞IL-8的表达,并抑制细胞增殖,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌Cag-PAI hp0525基因的克隆表达及其重组蛋白HP0525对SGC-7901细胞增殖的影响

目的：由于文献报道幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是产生胃溃疡和胃癌的致病菌之一,一个重要的影响因素是由cag致病岛编码的四型分泌系统。Hp0525是Cag致病岛中重要成分,是一种内膜蛋白ATPase。而幽门螺杆菌中Cag蛋白的表达以及Cag PAI编码的各自蛋白功能研究得还很少,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和研发幽门螺杆菌诊断试剂盒及疫苗,特克隆幽门螺杆菌NCTC 11637hp0525 (caga) 基因,并对其进行测序,构建原核重组质粒,表达HP0525蛋白,初步研究其对SGC-7901细胞增殖的影响。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增hp0525编码基因片段,克隆至pMD18-T载体后,再将其定向插入pET-30a载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,以DNA自动分析仪进行序列测定。测序分析正确后,经IPTG诱导表达,表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化,并经Western blot和MALDI-TOF鉴定,透析除盐后的蛋白,通过免疫新西兰大白兔和抗体效价的测定,纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞,用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响。结果：成功克隆hp0525基因,全长993bp,编码330个氨基酸,与GenBank 公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%~99%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量为36 000,与预期一致,经Ni2＋-NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋白。蛋白作用于SGC-7901细胞后,结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。它是一种ATPase,通过测定具有一定的活性。活性为4.40IU/ml结论：成功克隆hp0525基因,并在大肠杆菌BL21中表达,经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白, MTT法来检测出重组蛋白抑制细胞增殖;同时具有一定的酶活力,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃部特定的病原菌,感染呈全球分布,感染率高达50%以上。现已证实它是轻度胃炎,消化性溃疡及胃癌的主要病因。Ⅰ型H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该片段只出现于致病相关菌株,基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,TFSS),通过转运相关毒素而参与H.pylori诱导上皮细胞细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NF-κB、诱导促炎细胞因子白细胞介素-8的表达等,故在H.pylori的致病中起着关键作用。近年来,研究者们致力于研究Ⅳ型分泌系统的功能,但是对于这个装置是如何转运蛋白进入宿主细胞的确切机制还是知之甚少,因此,对Ⅳ型分泌系统的研究将有助于进一步明确H.pylori致病机制,并为临床诊断和治疗提供新的靶点。     

恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者诊断中的应用

目的评价恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染患者下呼吸道感染病原体检测中的效果。方法收集合格痰标本146例,通过恒温扩增芯片法和细菌培养法检测病原体,对两种方法检测结果进行分析。结果 146例痰液标本中,恒温扩增芯片法检出阳性标本114例(阳性率为78.1%),其中单一致病菌感染42例,2种及以上致病菌混合感染72例。45例标本检测到mecA基因,其中13例为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。146例痰标本中,有109例痰标本同时进行了痰培养检测,痰培养阳性率为67.9%(74/109),相应的恒温扩增芯片法检测阳性率为82.6%(90/109);痰培养结果阴性共计35例,与之相符合的恒温扩增芯片法检测阴性共计16例(阴性符合率45.7%)。恒温扩增芯片法对肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌的阳性检出率明显高于痰培养,差异具有统计学意义。恒温扩增芯片法检测到2例结核分枝杆菌复合群、1例军团菌、1例肺炎支原体,痰培养检测到3例奇异变形杆菌。结论本实验室所开展的恒温扩增芯片法在重症监护病房肺部感染者下呼吸道病原体检测方面的优势体现在阳性率高、检测时间短,可为临床肺部感染诊断提供及时准确的参考依据。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统HP0527-C基因的克隆表达及其生物学功能的初步研究

为克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC 11637 hp0527-c 基因,探讨其生物学功能。设计引物扩增,T-A克隆,测序正确后构建表达载体pET-28a- hp0527-c,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后以Ni2＋-NTA柱获得纯度为98％重组蛋白。经Western blot鉴定正确后,免疫新西兰大白兔获得了较高滴度的多克隆抗体;将重组蛋白作用于BGC-823细胞,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达增高;同时用MTT法来检测重组蛋白对细胞增殖的影响,结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。已成功克隆了HP0527-C的重组蛋白,初步探讨了其与细胞之间的相互作用,为进一步阐明H.pylori致病机制奠定了基础。