姬松茸原生质体形成和再生的研究

报道了溶壁酶系统、酶浓度、不同菌龄、脱壁促进剂、渗透压稳定剂和酶解温度对姬松茸原生质体释放率及不同再生培养基、渗稳剂种类、菌丝酶解时间和单双层平板对原生质体再生的影响。结果表明 ,菌龄为3～ 5d的菌丝以 1.5 %溶壁酶、0 .5 %蜗牛酶和 0 .5 %纤维素酶组成的酶系统在 30℃以KCl为渗透压稳定剂时 ,形成率为 1.4～ 1.5ⅹ 10 7/mL酶液 ;以蔗糖为渗透压稳定剂 ,菌丝酶解 1.5～ 3h ,以SMY和MYP为再生培养基 ,姬松茸原生质体再生率为 1.1‰～ 1.3‰。     

高效甘蔗黑穗病菌原生质体的制备

原生质体质量是丝状真菌遗传转化成功的关键。本研究以甘蔗黑穗病菌为试验材料,对其原生质制备和再生的条件进行研究。结果表明,将甘蔗黑穗病菌单倍体菌株JG36摇床培养24 h,然后加入5 mg/m L溶壁酶、30 mg/m L纤维素酶和30 mg/m L蜗牛酶的混合酶液,28℃160 r/min摇床上酶解3 h。1.2 M/L Mg SO_4作为原生质体制备时的渗透压稳定剂。在此条件下,制备原生质体得率最高达86.86%,原生质体再生率达到63.26%。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

古尼虫草小孢变种无性型原生质体制备及再生条件的研究

以从古尼虫草小孢变种Cordyceps gunnii var.minor上分离的无性型古尼拟青霉小孢变种Paecilomyces gunnii var.minor G106M为出发菌株,进行原生质体制备及再生条件的研究。将培养16h的菌丝体用溶壁酶和蜗牛酶的混合酶液于28℃酶解1.5~2h,原生质体产量可达3.74×107/mL。以培养12h的菌丝制备的原生质体在0.6mol/L氯化钠的SDAY培养基上再生率最高,为17.92%。     

木质层孔菌原生质体的制备与再生条件的研究

目的：提高木质层孔菌原生质体的产量和再生率,为进一步诱变育种提高菌株产木质纤维素酶活力打下基础。方法：通过单因素实验分别筛选合适的酶浓度、菌丝的菌龄、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂与pH值。结果：在酶解液浓度为2.0%纤维素酶＋2.0%蜗牛酶、菌龄60h、酶解温度32℃、酶解时间3h,以0.8mol/L的NaCl溶液为渗透压稳定剂,pH值为5.0时,原生质体形成量达4.13×10^5个/mL,再生率可达6.95%。有效地提高了木质层孔菌原生质体的产量和再生率。     

轮梗霉原生质体的制备*

本文比较了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解温度和时间等因素对轮梗霉原生质体得率的影响。结果基本获得了制备原生质体的适宜条件:用0.6mol/L甘露醇稳渗剂配制成的4%纤维素酶和0.5%蜗牛酶混合酶,35℃酶解培养了30h的菌丝1.0h,即可得到较高产量的原生质体。对该原生质体进行了再生实验,其再生率约为23.8%。     

木耳属种间杂交技术研究 Ⅰ.木耳菌丝原生质体的形成与再生

本文比较了不同酶液、渗透压稳定剂、酶解温室及菌丝培养基成份等因素对木耳属(Auricularia)中木耳(Auricularia auricula)和毛木耳(Auricularia polytricha)菌丝释放原生质体的作用及影响。用0.5%纤维素酶加0.5%蜗牛酶的混合酶液,以0.6M的MgSO_4为稳定剂,在34℃下可自两种菌丝体获得大量原生质体。对原生质体再生条件的研究表明,纤维二糖和菌丝体培养物浸提物对再生有明显促进作用,再生率达20%左右。本文还用VBL型荧光增白剂观察了菌丝脱壁以及原生质体细胞壁再生的过程。     

去壁酶与酶解方式对曲霉原生质体释放的影响

研究了纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶以及菌丝体培养方式和酶解方式对黑曲霉和米曲霉菌丝释放原生质体的效应。发现黑曲霉菌丝原生质体制备最佳条件为固体透析培养菌丝体,2%纤维素酶,在平皿中,28℃和80r/min条件下酶解3h;米曲霉原生质体制备最佳条件为2%纤维素酶+1%蜗牛酶+5mmol/L二硫苏糖醇,酶解时间6h,其它条件与黑曲霉的相同。     

人参皂苷F1转化菌株的原生质体诱变育种

菌核青霉2246(Penicillium sclerotiorum)能够将人参皂苷Rg1转化为人参皂苷F1.以此菌为出发菌株,进行原生质体制备和再生的研究,确定原生质体的最佳形成条件:菌丝体培养24 h,用5 mg/mL溶壁酶、5mg/mL纤维素酶和5 mg/mL蜗牛酶的混合酶液进行酶解,以0.8 mol/L的KCI作为渗透压稳定剂,31℃水浴振摇2h.并对形成的原生质体进行亚硝基胍复合紫外线照射诱变,结果得到1株转化率显著提高、遗传性能稳定的诱变株( NU-1),其转化率由16.7％提高到30.5％.     

姬菇原生质体制备与再生条件初探

目的探索姬菇(Pleurotus cornucopiae)菌丝原生质体制备和再生条件.方法以培养5d的幼嫩菌丝体为材料,在1.5%溶壁酶 0.5%纤维素酶混合酶作用下,以0.6mol/L甘露醇作渗透压稳定剂于pH5.5,30℃酶解2.5h,然后用血球计数板计数,计算原生质体产量.结果在上述条件下,原生质体产量达到3.12×107个/mL.原生质体适宜的再生培养基为马铃薯200g,蔗糖20g,酵母膏2g,KH2PO4 3.0g,MgSO4 ·7H2O 1.5g,维生素B1 0.1g,0.6mol/L甘露醇.采用上述培养基,原生质体再生率达到O.78%.为姬菇原生质体诱变及融合育种奠定了基础.     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。     

灭蚊真菌——大链壶菌原生质体形成和再生的研究

采用1％纤维素酶与1％真菌脱壁酶混合液作脱壁酶,0.6mol/L山梨醇为渗透压稳定剂,从摇床培养的12—14小时菌龄的大链壶菌(Lagenidium giganteum)菌丝体获得原生质体。酶解3—5小时后,产量可达1.4—2.0×10~6/mL。并在双层培养基上初步实现了原生质体再生。     

PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立

对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph（含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph）转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。     

小麦白粉病生防菌G-1菌株原生质体诱变育种

以链霉菌G-1(Streptomyces sp.G-1)为出发菌株,通过研究菌株G-1原生质体形成与再生的条件,发现该菌株在含0.5%甘氨酸的菌丝体培养基中经过二次培养后,所得菌丝体用2 mg/mL溶菌酶在30℃下处理90 min,可获得大量原生质体,其再生率可达8.2%。菌株G-1的原生质体经紫外诱变和宁南霉素抗性筛选后,得到一高产突变株G-1-125,其有效组分A的产量达到794mg/L,较出发菌株提高了180%。     

Construction of an RNAi expression vector and transformation into Penicillium chrysogenum

In this work, we constructed an RNAi vector for attenuation of the class III chitin synthase gene chs4, which plays a major role in hyphal growth and conidia formation. To achieve a high transformation frequency, factors affecting the preparation and regeneration of protoplasts were analyzed. The maximum numbers of protoplasts (1.41?×?10⁷ mL^?1) were released when mycelia cultured for 48 h were incubated at 30 °C for 5 h in a buffer containing 4 mg mL^?1 lysing enzyme. The maximum regeneration rate (33 %) was obtained when mycelia were digested for 4 h and plated on a regeneration medium containing 1 % overlaid agar. Quantitative real-time PCR was performed to validate the transformation efficiency, and it revealed knockdown of chs4 gene in randomly selected transformants at different levels. Dramatic reductions in the formation of conidia and the hyphal growth rate were observed in most of the transformants.     

蓝色犁头霉原生质体的制备与再生

研究了氢化可的松生产菌蓝色犁头霉原生质体的形成与再生。通过对溶解酶系统的选择,影响原生质体形成的因素如渗透压稳定剂、酶浓度、菌龄、菌丝培养基和培养方式等因素进行考察,发现以0．4mol/L NH4Cl做为稳定剂、2．5mg/mL溶壁酶和5mg/mL纤维素酶组成的混合酶液溶解菌丝,4h后原生质体量可达10^6cell/mL。通过显微镜观察原生质体的形成过程以及在高渗培养基上的再生情况,再生率为15．6％。     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。