生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因转录谱分析

【目的】探究生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的差异基因表达情况,为今后研究生物膜形成调控机制提供基因信息。【方法】以非生物膜形成条件下为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）研究,分析生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因表达情况,并采用实时定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）进行验证。【结果】本研究共获得979个差异显著性表达基因（differentially expressed gene,DEG）,其中下调基因379个,上调基因600个。基因本体（gene ontology,GO）分类分析结果显示,共有363个DEGs注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）代谢途径分析结果显示,共有706个DEGs归到37个代谢通路中（Q value<0.05）,差异表达基因主要集中在细胞代谢和转运通路上;蛋白相邻类的聚簇（clusters of orthologous groups,COG）分类结果显示,有888个DEGs可归为20个类别,涉及DEGs最多的为氨基酸转运与代谢、一般功能预测基因、能量产生与转换以及未知功能基因。qPCR验证挑选的DEGs变化趋势均与RNA-seq的结果一致。此外,从转录组数据中共筛选出10个c-di-GMP代谢相关基因、1个侧生鞭毛蛋白基因（lafA）、13个极生鞭毛合成相关基因、6个荚膜多糖合成相关基因、6个胞外多糖合成相关基因、5个IV型菌毛合成相关基因、膜融合蛋白（membrane fusion protein,Mfp）基因（cpsQ-mfpABC）、14个III型分泌系统1（T3SS1）相关基因、14个Vp-PAI基因（1个tdh2和13个T3SS2基因）、3个VI型分泌系统1（T6SS1）相关基因、6个T6SS2基因、45个推定调控子基因和15个推定的外膜蛋白基因。【结论】生物膜形成引起副溶血弧菌基因表达谱发生明显变化,差异表达基因中包含生物膜形成相关基因、关键毒力基因和许多推定调控子基因等,这为后续研究生物膜形成调控机制提供重要信息。     

东乡野生稻及其渐渗系应答低磷胁迫的基因差异表达分析

以东乡野生稻耐低磷渐渗系IL171及其双亲(栽培稻‘协青早B’和东乡野生稻)为试材,采用cDNA-AFLP技术分析其幼苗期应答低磷胁迫的差异表达谱特征,并采用实时荧光定量PCR分析验证差异表达基因的表达特性,为探究东乡野生稻耐低磷胁迫的分子机制、发掘耐低磷相关的基因奠定基础。结果显示:(1)基于17对扩增效果较好的cDNA-AFLP引物分析发现,不同胁迫时间的参试材料与其对照组(正常磷水平)相比,具有很多(20~159个)上调或下调表达的差异片段。(2)与‘协青早B’相比,IL171中特异性上调的差异带有36条,下调表达61条,而东乡野生稻中分别有79条和136条;IL171与东乡野生稻共有的上调差异带为13条,下调差异带有15条。(3)回收纯化其中60条特异性差异表达条带,最终克隆测序获得50个差异表达基因片段TDFs;通过Blast比对和功能分析,可将TDFs分为8类,包括能量与代谢、基因表达调控、信号转导和转录因子等。(4)实时荧光定量PCR验证其中6个TDFs发现,各差异片段的荧光定量PCR表达模式与cDNA-AFLP结果一致,表明该实验的cDNAAFLP差异表达结果可靠,东乡野生稻的部分耐低磷相关基因已成功导入到渐渗系中,是发掘利用东乡野生稻耐低磷相关基因、探究其耐低磷分子机制的重要资源。     

基于比较转录组学分析NaCl胁迫影响德尔卑沙门氏菌的耐渗机制

【目的】研究高渗胁迫条件下德尔卑沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica Derby, S. Derby)的转录组调控机制,分析差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)表达水平,探究在高渗胁迫影响下德尔卑沙门氏菌耐渗反应的相关代谢通路。【方法】通过高渗胁迫诱导德尔卑沙门氏菌的耐渗性,提取菌株的总RNA,去除rRNA,构建cDNA文库。利用转录组测序技术及生物学信息技术分析相关DEGs,并通过实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)进行验证。【结果】胁迫组德尔卑沙门氏菌通过转录组测序结果发现有3 950个DEGs,其中具有显著上调的基因21个,显著下调基因38个。涉及到细胞膜蛋白、氨基酸的代谢等相关基因上调,协助德尔卑沙门氏菌在高渗环境中存活。与此同时,胁迫组德尔卑沙门氏菌的糖转运系统(sugar transport system, PTS)、糖酵解过程以及抗氧化性相关基因表达显著下调,这是由于高渗环境菌体需要在体内储存大量糖类等物质,从而降低了糖原的消耗,进而导致细胞外膜的脂多糖合成受到抑制,降低了高渗胁迫下德尔卑沙门氏菌细胞膜表面的O抗原的合成。【结论】高渗环境诱导后显著提高了德尔卑沙门氏菌的耐渗性,其中Na⁺/H⁺逆向转运蛋以及谷氨酸的代谢通路发挥着重要的作用,为进一步了解以及更好地控制其在食品中的污染提供了理论依据。     

基于转录组的肝豆状核变性调控网络的构建和分析

本研究旨在利用生物信息学方法构建经铜诱导的ATP7B基因敲除HepG2细胞系的转录调控网络。探讨关键转录因子在肝豆状核变性发生、发展中的潜在作用机制。收集公共基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）中包含野生型、ATP7B基因敲除型、铜诱导的野生型和铜诱导的ATP7B基因敲除型HepG2细胞系数据。筛选由铜诱导产生的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）后进行基因本体论（gene ontology,GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析。基于蛋白相互作用网络,识别疾病关键基因和功能模块,并对关键功能模块中的基因进行富集分析。最后,构建转录调控网络,筛选核心转录因子。共筛选出1 034个差异表达基因,其中上调525个,下调509个。上、下调关键功能模块分别包括了3 785个和3 931个基因。关键功能模块中的基因主要定位于细胞-基质连接、染色体、剪接复合体、核糖体等区域,共同参与了mRNA加工、组蛋白修饰、RNA剪切、DNA代谢调节、蛋白磷酸化等生物学过程,且与转录共调控活性、DNA转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等分子功能相关。KEGG分析表明功能模块中的基因显著富集的通路包括乙型肝炎、有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路、细胞衰老和凋亡、神经营养信号通路和神经变性途径等。肝豆状核变性转录调控网络包括11个差异表达转录因子和96个差异表达基因,其中U2AF1、NFRKB、FUS、MAX、SRSF1、CEBPA和RXRA为核心差异表达转录因子。该研究为肝豆状核变性转录调控相关分子的生物学功能研究提供了重要的参考依据。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

烟草幼苗响应弱光胁迫的转录组分析

为了研究烟草幼苗对弱光胁迫反应的分子机制,以'云烟87'为材料,构建全光照和弱光处理条件下大十字期烟苗cDNA文库,利用Illumina测序技术进行转录组测序,筛选差异表达基因.结果表明:借助RNA-seq技术共筛选到2 956个DEGs,其中弱光相对于全光照表达上调的DEGs有691个,表达下调的DEGs为2 265个;通过GO功能分类和KEGG富集分析,将差异基因划分为30个功能类别和113个代谢途径,包括代谢进程、碳水化合物结合、核酸结合转录因子活性、水解酶活性、转录因子活性、催化活性、内质网蛋白质加工、植物-病原体互作、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、胁迫反应、激素信号转导以及光合作用等.本研究将为揭示烟草对弱光胁迫反应的分子机制提供理论依据.     

高油酸花生发芽期低温胁迫转录组及差异表达基因分析

高油酸花生(ArachishypogaeaL.)油具有优异的营养成分和热氧化稳定性,有利于人体健康和工业生产。但是高油酸花生在发芽期间对温度比较敏感,限制了其在低温地区的引种。为了进一步了解高油酸花生在发芽期响应低温胁迫的分子机制,本研究选用田间试验中耐寒表现不同的4种高油酸花生品种,分析其在发芽期低温胁迫下的全基因组水平调控。通过转录组高通量测序共获得139429条Unigene,其中两组耐寒与不耐寒高油酸花生品种在低温胁迫下共产生差异表达基因(differentially expressed gene, DEG) 3520个,且耐寒花生中上调表达的DEG数目大于下调表达的数目。GO分析表明,耐寒高油酸花生中有关细胞膜代谢与完整性以及细胞外周蛋白差异表达基因的数量较多;KEGG通路分析表明,植物病原相互作用和植物激素信号转导通路在抗寒中起着重要作用。进一步筛选出4个低温诱导蛋白基因——时钟调控蛋白基因(TIC)、AGO4蛋白基因(AGO4)、组蛋白–赖氨酸N甲基类转移酶ATX3基因(ATX3)、FERONIA类受体蛋白激酶基因(FER)和3个转录因子基因——bHLH、3R-1MYB和EREB,采用qRT-PCR检测这些基因在低温胁迫下的表达量。结果显示,在低温处理3h后TIC、ATX3和AGO4以及转录因子基因bHLH、MYB和EREB的表达量明显升高,FER在胁迫12h后也有明显升高,表明这些基因在花生萌发期响应低温胁迫。本研究为深入了解高油酸花生发芽期低温胁迫转录调控机制和筛选花生抗寒基因提供了数据资源。     

茶树CsLEA5基因的克隆及表达分析

该研究以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树胚胎发育晚期丰富蛋白基因CsLEA5的cDNA序列,该序列全长515 bp,包含一个375 bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,预测蛋白分子量为13.5 kD,理论等电点为5.92。蛋白序列分析结果显示,CsLEA5为高亲水性和稳定性蛋白,且含有一个典型的LEA_3保守结构域,属于LEA蛋白中LEA_3亚家族成员。CsLEA5基因启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如乙烯响应元件（ERE）、胁迫响应元件（STRE）、创伤响应元件（WUN motif）及MYB、MYC转录因子识别位点等。qRT PCR分析显示,CsLEA5基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的表达量最高,其次是嫩茎,而在其他组织器官中的表达量较低,且CsLEA5基因表达受低温和干旱胁迫的诱导。研究表明,CsLEA5基因可能在茶树响应低温和干旱胁迫过程中发挥重要作用。该研究对了解茶树抗逆分子机制,筛选抗性候选基因资源提供了重要理论依据。     

木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究

MYC2（MYeloCytomatosis）转录因子是植物应对逆境胁迫过程中茉莉酸信号传导相关的核心转录因子。本研究旨在初步分析木薯MeMYC2.2基因在低温胁迫响应中的功能。利用生物信息学分析木薯MeMYC2.1和MeMYC2.2基因的结构及其编码蛋白的理化性质;通过定量PCR分析了上述2个基因在木薯组培苗叶片中对低温胁迫的响应;通过转基因拟南芥研究MeMYC2.2的抗冻功能。木薯组培苗叶片中2个MeMYC2基因的表达均在低温胁迫早期被诱导,其中,与MeMYC2.1相比,MeMYC2.2差异表达更显著。MeMYC2.2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显转录自激活功能,表明该蛋白具有转录因子特性。与野生型相比,过表达MeMYC2.2的转基因拟南芥抗冻能力显著提高。在低温处理下,CBF3基因在转基因拟南芥中的表达量要明显高于其在野生型的表达量,但另外3个CBF基因在转基因拟南芥中的表达量明显下降。木薯MeMYC2.2的表达受低温和茉莉酸调控,可以提高植物的抗冻性,且可能影响CBF基因对低温的响应。本研究为进一步利用MeMYC2基因改良木薯的低温耐受性奠定了理论基础。     

阿尔泰蝠蛾(鳞翅目:蝙蝠蛾科)幼虫低温胁迫转录组分析

[目的]本研究旨在通过转录组测序技术分析低温胁迫引起的阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola Wang幼虫基因转录差异及上调表达基因的主要功能类群和参与的主要代谢通路.[方法]采用Illumina HiSeq TM 2500测序平台对阿尔泰蝠蛾幼虫进行转录组测序、组装,利用Blast软件进行数据库比对和基因功能注释,用DEGSeq R软件包分析4℃低温处理与室内适温饲养试虫的差异表达基因,并对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析.[结果]经序列拼接后共获得100300个unigenes,总长度81600309 bp,平均长度813 bp,N50长度1719 bp.与7大数据库同源比对,共获得34691(34.59％)条unigenes.低温胁迫转录组分析得到11569个差异表达基因(DEGs),7158条基因上调,4411条基因下调.富集到47个GO类群,217个KEGG途径.其中代谢过程、催化、结合活性类群占有重要比例,核糖体、碳代谢、剪接体等途径显著富集.另外,热激蛋白、昆虫表皮蛋白、海藻糖酶、超氧化物歧化酶等非生物胁迫相关基因显著上调表达.[结论]阿尔泰蝠蛾幼虫低温胁迫转录组分析揭示,代谢过程、细胞过程、生物调节、对刺激的反应等生物学过程相关基因和部分非生物胁迫响应基因显著上调表达,提示蝠蛾幼虫可能从抗氧化防御、分子伴侣、体温调节和维持细胞的渗透平衡等多方面应对低温胁迫.     

茶陵野生稻苗期耐冷性与抗氧化系统的关系

为探讨茶陵野生稻苗期耐冷的生理机制,以耐冷性强弱不同的栽培稻及东乡野生稻为对照,研究了茶陵野生稻苗期冷胁迫后抗氧化系统的变化.结果表明,茶陵野生稻经冷胁迫后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及抗坏血酸(AsA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量增加幅度大于冷敏感对照,而稍小于或相当于耐冷对照;超氧阴离子(O2)产生速率和丙二醛(MDA)含量低于冷敏感对照品种,而稍高于或相当于耐冷对照.说明茶陵野生稻苗期耐冷性与其抗氧化系统冷胁迫后的适应性变化密切相关.     

A novel functional gene associated with cold tolerance at the seedling stage in rice

Identification and cloning of cold‐tolerant genes that can stably express under different cold environments are crucial for molecular rice breeding for cold tolerance. In the previous study, we identified a cold‐tolerant QTL at the seedling stage, qCTS‐9 which could be detected under different cold environments using a recombinant inbred line (RIL) population derived from a cold‐tolerant variety Lijiangxintuanheigu (LTH) and a cold‐sensitive variety Shanhuangzhan 2 (SHZ‐2). In this study, eight candidate genes within the qCTS‐9 interval were identified through integrated analysis of QTL mapping with genomewide differential expression profiling of LTH. The qRT‐PCR assay showed that only Os09g0410300 exhibited different expression patterns between LTH and SHZ‐2 during cold stress, and significantly positive correlation was found between cold induction of Os09g0410300 and seedling cold tolerance in the RI lines. Five SNPs and one InDel in the promoters of Os09g0410300 were detected between LTH and SHZ‐2, and the InDel marker ID410300 designed based on the insertion–deletion polymorphism in the promoter was significantly associated with seedling cold tolerance in RIL population. Further, Os09g0410300 over‐expression plants exhibited enhanced cold tolerance at the seedling stage compared with the wild‐type plants. Thus, our results suggest that Os09g0410300 is the functional gene underlying qCTS‐9. To our knowledge, it is a novel gene contributed to enhance cold tolerance at the seedling stage in rice. Identification of the functional gene underlying qCTS‐9 and development of the gene‐specific marker will facilitate molecular breeding for cold tolerance at the seedling stage in rice through transgenic approach and marker‐assisted selection (MAS).     

Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene (OrbHLH001) from Dongxiang Wild Rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis

Dongxiang Wild Rice (Oryza rufipogon) is the northernmost wild rice in the world known to date and has extremely high cold tolerance and many other adversity-resistant properties. To identify the genes responsible for the high stress tolerance, we isolated and characterized a basic helix-loop-helix (bHLH) protein gene OrbHLH001 from Dongxiang Wild Rice. The gene encodes an ICE1-like protein containing multiple homopeptide repeats. Expression of OrbHLH001 is induced by salt stress and is predominant in the shoots of wild rice seedlings. Overexpression of OrbHLH001 enhanced the tolerance to freezing and salt stresses in transgenic Arabidopsis. Examination of the expression of cold-responsive genes in transgenic Arabidopsis showed that the function of OrbHLH001 differs from that of ICE1 and is independent of a CBF/DREB1 cold-response pathway.     

东乡野生稻苗期耐冷性的遗传分析

以强耐冷材料龙稻5号（Oryza sativa ssp.japonica）和冷敏感材料协青早B（O.sativa ssp.indica）为对照品种,以萎蔫率和死苗率为鉴定指标,利用江西东乡普通野生稻（O.rufipogon）/协青早B//协青早B构建的回交重组自交系（backcross in-bred lines,BILs）群体（BC1F9）进行苗期耐冷性鉴定和遗传分析。结果表明,10°C冷处理7天后,228个BILs群体的平均萎蔫率为67.4%,平均死苗率为70.8%。将死苗率≤20%的株系,在更低温度（8°C昼/5°C夜）下处理5天,结果显示5243和5335为强耐冷材料,可用于构建东乡野生稻QTL（quantitative traitloci）近等基因系（near-isogenic lines,NILs）。实验结果显示,群体萎蔫率和死苗率均呈偏态的连续分布,暗示东乡野生稻苗期耐冷性表现为质量-数量性状遗传特征,由主基因-多基因控制。