尖吻蝮蛇蛇毒中一种新型酸性磷酯酶的纯化和表征

从尖吻蝮蛇蛇毒中, 通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、Blue胶和POROS HQ20离子交换色谱,分离纯化得到纯组分AA-PLA₂-I,并证明其为新型酸性磷酸酯酶A₂ 经鉴定,该酶为分子量14.4 kD的单体蛋白,等电点5.66,不含中性糖基,N端序列为SLIQFETLIMKVVKK,其磷酸酯酶A2活性的最适温度和pH条件分别为50 ℃ 和 pH 10此外,该酶蛋白酶活性较弱,无出血毒性,但具有抗凝血活性,且其抗凝血活性耐热至70 ℃.     

蕲蛇蛇毒中一种新型金属蛋白酶AA-MP-I的纯化和表征

本研究通过嗜硫色谱、Sephadex G-75、蓝胶和POROS HQ20离子交换色谱,从蕲蛇蛇毒中分离得到一种新组分AA-MP-I。该酶为分子量22.9kDa的单体蛋白,等电点为5.55,不含中性糖基,N端序列为STE-FQRYMEIVIVVDHSMVK,结果表明其为新型P-I型金属蛋白酶,对温度敏感,具有抗凝血活性,40℃下抗凝血活性最强,具有出血毒性,无磷脂酶A2活性。     

菜花烙铁头蛇毒中一种具有激肽释放酶与纤维蛋白原溶酶活性的Jerdonase

通过DEAESephadexA 5 0阴离子交换、超细SephadexG 10 0分子筛和反相高效液相C4 色谱层析 ,从菜花烙铁头蛇毒冻干粉中纯化出一种具有激肽释放酶活性和α纤维蛋白原溶酶活性的丝氨酸蛋白酶 ,命名为Jerdonase。在 12 .5 %胶浓度的SDS还原电泳条件下 ,该酶分子量大约为 5 5kD ,在非还原电泳条件下 ,分子量大约为 5 3kD。此酶是一种糖蛋白 ,含有约 35 .8%的中性糖。它的N末端氨基酸序列为IIGGDEENINEHPFLVALYDA ,其序列和蛇毒中其他丝氨酸蛋白酶具有非常高的序列相似性。Jerdonase能够催化BAEE、S 2 2 38和S 2 30 2的水解 ,其水解活性可被PMSF抑制 ,但是EDTA对此没有影响。Jerdonase能优先水解人纤维蛋白原的Aα链 ,同时伴随有微弱的Bβ链水解活性。另外 ,此酶能够水解牛低分子量的激肽原 ,释放舒缓激肽。总之 ,所有的结果表明Jerdonase是一个具有多功能活性的蛇毒丝氨酸蛋白酶     

菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的分离纯化和理化性质

以前从菜花烙铁头蛇毒中分离纯化到Jerdonitin。与其他Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶相比,Jerdonitin由金属蛋白酶和去整合素两个结构域组成。但没有检测到其出血和纤维蛋白原降解活性,推测可能高压液相色谱的有机溶液影响了其酶活性。采用不含高压液相色谱柱层析的新分离手段分离得到Jerdonitin。Jerdonitin在还原和非还原SDS—PAGE电泳中分别呈现一条表观分子量为38和36kDa的条带。像其他典型的蛇毒金属蛋白酶一样,Jerdonitin优先降解人纤维蛋白原的alpha链,并且该活性能被EDTA完全抑制,而PMSF对其没有影响。Jerdonitin不诱导小白鼠皮下出血。     

蕲蛇蛇毒抗凝血因子的分离纯化与特性

目的 寻找蕲蛇蛇毒中的抗凝血因子。方法 利用硫酸铵沉降、阴离子交换层析、阳离子交换层析及高效液相色谱层析,从蕲蛇蛇毒中分离纯化到一个抗凝血因子。结果 纯化的这一组份在PAGE、SDS—PAGE上均呈单一区带,分子量约为25．4kD,由两条分子量分别为15．0kD和16．0kD的肽链通过二硫键连接在一起。这一组份在体外显著地延长血浆复钙时间和凝血酶原时间,但不延长牛凝血酶时间,也不具有磷脂酶A2活性、纤溶活性和出血活性。结论 蕲蛇蛇毒中舍右一种新的抗凝血因子。     

蛇毒纤溶酶原激活剂TSV-PA在昆虫细胞中的表达

将蛇毒TSV PA基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTa中 ,在粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞中进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物为分子量 33kD的TSV PA蛋白 ,Western印迹分析也证实了此结果。酶活力测定结果表明 ,昆虫细胞表达的TSV PA蛋白具有较高活性     

激光对香石竹愈伤组织蛋白质和同工酶谱的影响

用氦氖激光处理香石竹愈伤组织,可使材料中的34kD和28kD蛋白含量高于对照,并产生分子量约为22kD的新的蛋白带。而用氩离子激光处理后,则出现一条分子量约为45kD的新的蛋白带。此外,激光处理亦明显影响愈伤组织的过氧化物酶同工酶谱及其活性,其中氦氖激光处理后产生了Rf为0.17和0.26的新酶带,而用氩离子激光处理则只产生Rf为0.17的新酶带。激光对香石竹愈伤组织的酯酶同工酶无影响。     

绿色糖单孢菌木质素过氧化物酶的分离纯化及鉴定

木质素过氧化物酶是一种重要的具有工业应用前景的木质素降解酶,但已报道真菌来源的木质素过氧化物酶只能在酸性低温条件下发挥作用,限制了其进一步的工业应用.通过培养一株耐热耐碱放线茵——绿色糖单孢茵发酵产酶,采用DEAE-Cellulose,CM-Cellulose和Superdex 75凝胶过滤层析等分离纯化方法,得到一种具有耐热耐碱特性的木质素过氧化物酶.经凝胶电泳检测其为单一蛋白,分子量为41 kD.最终纯化倍数达到20倍,活性回收率为6％.采用LTQ法对纯酶进行蛋白质归类鉴定,得到其部分氨基酸片段,为该酶的进一步分子生物学研究奠定基础.     

高产蛋白酶菌株Bacillus cereus KM-4的产酶实时动态研究

从昆明豆豉样品分离得到一株蛋白酶活性较高的菌株,其酶活达14.58 U/mL.采用SDS-gelatin-PAGE蛋白电泳及Zymography染色,结合茚三酮法测定其蛋白酶活性,对KM-4菌株分泌的蛋白酶进行酶谱分析.结果表明,培养pH6.0有利于该菌株分泌分子量约为116 kD的蛋白酶,经明胶诱导培养后,其酶活明显提高,推测其所分泌的蛋白酶可能需要蛋白质诱导.     

辐射过程中耐辐射奇球菌蛋白酶变化的检测与分析

采用明胶和酪蛋白底物酶谱法以及荧光酪蛋白底物对紫外线以及γ射线辐射后恢复期耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radiodurans R1,DRR1)的蛋白酶变化进行了检测。结果发现,DRR1存在高活性大分子量组成性表达蛋白酶,与Karlin等［16］提出的DRR1蛋白酶为预测高表达蛋白(PHX)的设想一致。DRR1包含大量分子量大于140kD 的明胶降解酶和分子量大于120kD的酪蛋白降解酶,其中活性最高的174kD明胶酶在经SDS变性处理后仍有较高活性,该蛋白酶在DRR1受紫外线辐射和电离辐射后恢复期的表达模式存在差异,在γ射线电离辐射过程中以及电离辐射后恢复的晚期活性较高。此外,还发现一些蛋白酶特异性由辐射所诱导,表明这些蛋白酶可能参与细胞信号通路中蛋白的顺序降解,也提示DRR1损伤修复过程中细胞内存在一个精确的蛋白酶系统。这些蛋白酶的表达与细胞的营养状态相关。同时对一株由本实验室从北京地区土壤中分离到的杆状耐辐射菌RR533.2的明胶和酪蛋白蛋白酶谱进行了测定,结果发现其蛋白酶谱与DRR1相类似。     

小黑麦抗真菌蛋白组分的分离纯化和性质研究

以木霉为指示菌,小黑麦中饲237种子中的蛋白提取物经过分离纯化后,得到了3种主要的抗真菌蛋白组分,经酶活检测鉴定,分别是分子量为30.5 kD的ClassⅡ型几丁质酶,两种分子量为51kD和23 kD的β-1,3-葡聚糖酶。其中几丁质酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为37℃,测定的N末端氨基酸序列与大麦几丁质酶的有很高的同源性。在一定条件下,这3种蛋白组分都有较强的抗木霉活性,并且有明显的协同作用,同时它们对离体易感小麦叶片上白粉菌有很好的生长抑制作用。     

非洲爪蟾两种孵化酶分子对卵黄膜作用机制的探讨

在分离纯化非洲爪蟾孵化酶时,得到了60kD和40kD两种分子,用孵化酶的特异性抗GST-UVS.2抗体进行Western杂交的结果证明二者均为孵化酶分子.60kD分子很不稳定,在纯化过程中极易降解,40kD分子可能是由60kD分子经过降解或自身降解丢失了两个CUB重复区而形成的,而CUB重复区很可能在对受精膜分子结构的修饰或改造中具有重要作用.在进一步验证其蛋白酶活性和生物活性时, 发现二者几乎具有完全相同的蛋白酶活性, 而且均具有很强的卵黄膜溶解活性.这种卵黄膜溶解活性的结果暗示了它们对早期胚胎孵化进行调节的一个可能机制,即二者在降解受精膜和凝胶层的不同阶段相互配合、又各自扮演了不同的角色.由此可见,60kD分子降解或自身降解为40kD分子很可能是一种自然行为,而并非由于实验操作所致.     

猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探

为了进一步分析猪笼草瓶状体内消化液中蛋白质的性质,本研究在不同的温度和pH条件下测定消化液中蛋白酶的活性,并且比较了3种不同沉淀方法对消化液蛋白进行的浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺电泳对消化液蛋白作了初步分离.结果表明,猪笼草消化液中蛋白酶的最适酶活温度为50℃,且稳定性最高;当pH为5时,该蛋白酶活性出现峰值,采用氯仿-正丁醇法(5:1)沉淀浓缩猪笼草消化液蛋白样品效果最佳.聚丙烯酰胺电泳结果表明,消化液至少包括三种蛋白组分,分子量分别为24.3kD、35.1 kD和61.4kD,且35.1 kD条带具有抗胰蛋白酶消化活性.本研究为综合开发利用猪笼草野生资源提供理论依据.     

解淀粉芽孢杆菌BamHI甲基转移酶基因克隆、功能鉴定与序列分析

从解淀粉芽孢杆菌Baillus amyloliquefaciens CICIM B2125中克隆了BamHI甲基转移酶基因(bamHIM),并在大肠杆菌JM109中得到了成功表达.该基因含有1 271 bp的开放阅读框(ORF),编码423个氨基酸,成熟蛋白分子量为49 kD.该基因在自身启动子引导下,表达了具有活性的BamHI甲基转移酶(M.BamHI).该酶可以将BamHI位点的碱基甲基化.氨基酸序列分析表明该酶存在有NADB_Rossmann结构域.     

蛹虫草无性型深层培养液中纤溶酶的分离纯化和酶学性质研究

【目的】确立蛹拟青霉深层培养液中高纯度、高纤溶活性纤溶酶的分离纯化方法并测定其酶学性质。【方法】采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶色谱、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色谱、CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱和Superdex 75凝胶色谱对蛹拟青霉纤溶酶进行分离。用Lowry法测定蛋白质浓度,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性,SDS-PAGE鉴定其纯度并确定其分子量,IEF法测定其等电点。【结果】研究发现,以蔗糖和豆饼为培养基主要基质时,蛹拟青霉深层培养可以产生至少两种纤溶酶。提纯后的纤溶酶Ⅱ比活力达到800.46 U/mg,总纯化倍数为30.07倍。纤溶酶Ⅱ的相对分子量和等电点分别为32 kD和9.3±0.2。纤溶酶Ⅱ是一种糖蛋白,总含糖量为0.98%(W/V)。该酶可以顺次降解人血纤维蛋白(原)的α、β和γ链。其最适作用pH及温度分别为7.4和41°C。Aprotinine与PMSF对该纤溶酶的活性完全抑制,推测此纤溶酶可能是一种丝氨酸蛋白酶。【结论】单一的高纤溶活性纤溶酶的获得和酶学性质的确定,为该酶开发成为新型溶栓药物提供了理论依据。     

蜀柏毒蛾核型多角体病毒结构多肽及基因组酶切分析

对蜀柏毒蛾核型多角体病毒(Parocneria orienta Nuclear polyhedrovirus,简称PaorNPV)形态结构、结构多肽、限制性内切酶图谱等特性进行了研究.采用不连续系统垂直板SDS-PAGE分析了PaorNPV的多角体蛋白、病毒粒子结构多肽.应用5种限制性内切酶对PaorNPV基因组DNA进行了酶切分析.结果表明:经热处理的多角体蛋白仅有一条带,分子量为31.5 kD,不经热处理的多角体蛋白有三条带,分子量分别为31.5 kD、29.1 kD、28.6 kD;病毒粒子包含有25种结构多肽,分子量范围在17.6-114.6 kD之间.PaorNPV DNA经BamH I.EcoR I、HindⅢ、Pst I和Xho I酶切分别产生9、12、12、12和14条片段.基因组大小平均为124.6 kb.     

美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析

为了建立美洲大蠊Periplaneta americana变应原蛋白的质谱鉴定方法,我们将美洲大蠊粗浸液通过DEAE-52离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离步骤得到纯化的74 kD蛋白,对纯化前后的该74 kD蛋白分别进行SDS-PAGE及凝胶内胰酶酶切,再经液相色谱-电喷雾-串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）在线联机分析,所得质谱数据进入网站（http://www.matrixscience.com）进行Mascot检索比对。通过对两者质谱鉴定结果的比较来评估美洲大蠊天然主要变应原蛋白的纯化效果。结果表明,纯化蛋白经HPLC-ESI-MS/MS鉴定是美洲大蠊主要变应原蛋白;离子交换层析等纯化步骤可以去除同一分子量的杂蛋白(如卵黄原蛋白),从而获得较好的鉴定结果。我们首次成功地运用质谱建立起变应原蛋白的新鉴定方法。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步聚,得到一种纯度达95％以上的蚯蚓纤溶酶．该酶具有强烈的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为90OUK单位／毫克蛋白,TAME法测得其比活性为2500O单位／毫克蛋白．酶学性质研究表明其最适反应温度为65℃,最适反应PH值为8．5．该酶的分子量为33kD,等电点为pH3．5．还对该酶进行了氨基酸组成分析,并测定了其N端部分序列．     

四季豆幼苗中尿囊酸酰胺水解酶的一些特性

酰脲代谢在许多固氮豆科植物氮素代谢中起重要作用;尿囊酸的酰胺水解酶(EC3.5.3.9)分解尿囊酸成为脲基乙醇酸和CO2、NH3,脲基乙醇酸的酰胺水解酶进一步分解脲基乙醇酸产生乙醛酸和CO2、NH3.该文首次报告测定四季豆尿囊酸降解酶(分解尿囊酸的酶)的方法,酶反应基质需要盐酸苯肼存在.在四季豆干种子、幼苗根、茎和叶,均可测出尿囊酸降解酶活力.从四季豆幼苗分离出两个尿囊酸降解酶.一个分子量大于200 kD,另一个分子量为13.5 kD;小分子量的尿囊酸降解酶(没有脲基乙醇酸酰胺水解酶或脲酶活力)用于性质研究.酶反应产物分析表明,该酶是尿囊酸的酰胺水解酶.该酶反应的最适pH为8.5.Mn2 是该酶的金属辅助因子.Km为76μmol/L,Vmax为16.7 nKat/mg(=1 002 nmol min1mg1).乙醛酸和乙醇酸抑制该酶活力.赖氨酸残基和色氨酸残基是酶活力的必需基团;巯基和酪氨酸残基不是酶活力的必需基团.     

银杏种仁中一种抗氧化活性蛋白的纯化及性质

银杏种仁经破碎,提取缓冲液4℃浸取后离心得上清液。上清液经硫酸铵沉淀,DEAE-52离子交换层析,MonoQ离子交换层析,UltroGelACA-54凝胶过滤层析后,分离得到一种具有抗氧化活性的蛋白。该蛋白经UltroGelACA-54凝胶过滤层析测定分子量为60 kD,经PAGE和SDS-PAGE鉴定均为单一蛋白质条带。SDS-PAGE测定其亚基分子量为10 kD。该蛋白具有一定的还原能力和清除超氧阴离子自由基及DPPH自由基能力,并在30～60℃温度下具有良好的稳定性。