杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探

研究酶浓度、酶解时间、酶解温度、培养时间、稳渗剂种类、pH值和几种再生培养基对杏鲍菇原生质体制备与再生的影响。最适条件为 :在 30℃、pH5 .5、1.5 %溶壁酶条件下 ,以 0 .6mol L甘露醇作为稳渗剂 ,酶解 2 .5h ,原生质体产量达到 2 .90× 10 7个 mL。将所得原生质体过滤、纯化、稀释后涂布再生培养基 ,再生率为 0 .18%。为利用原生质体技术进行杏鲍菇育种奠定了基础。     

茯苓原生质体制备与再生条件的研究

研究了酶、酶解时间、菌龄、稳渗剂等对茯苓原生质体制备与再生的影响。茯苓原生质体制备的最佳条件为:纤维素酶(1．5%)和蜗牛酶(1．5%)的等量混合酶解系统,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,产量可达1．77×10~7个/mL。以甘露醇为稳渗剂,采用CYM再生培养基,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,其原生质体再生率最高,为0．164%。这一结果为茯苓通过原生质体技术进行菌种改良提供了重要技术参数。     

白腐真菌原生质体制备和再生条件的研究

对影响白腐真菌(5．776)原生质体制备和再生的条件：包括菌龄、水解酶液的种类及浓度、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂的选择进行了研究。通过单因素比较分析和正交实验得到最适合的白腐真菌原生质体制备和再生条件。结果表明：当菌龄为58h,采用1%纤维素酶和1%蜗牛酶(2：1)混合液,酶解温度30℃,酶解时间180min,用0．7mol/L氯化钠作渗透压稳压剂,白腐真菌(5．776)原生质体的形成数和再生率均比优化前大为提高,原生质体形成量为8．36×10~5个/mL,原生质体再生率为9．12%。     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。     

基于响应面法对香菇原生质体制备条件的优化

香菇Lentinula edodes是我国食用菌年产量最大的单品,优化香菇原生质体的制备条件,获得高质量、高活力的原生质体可以为香菇育种和遗传多样性分析提供技术保障。本研究利用单因素试验对稳渗剂浓度、酶解液类型、酶解时间、酶解温度4个因素的最优作用条件和相关性进行检验和筛选;依据单因素试验的结果,对酶解时间、酶解温度、酶解液种类进行响应面法3因素3水平试验优化分析。单因素试验结果表明,使用2%的溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶混合酶制剂为酶解液、0.6 mol/L甘露醇为稳渗剂的效果显著高于其他处理(P<0.05)。经Box-Behnken设计得出香菇原生质体最佳制备条件为酶解时间3.25 h,酶解液浓度1.7%,酶解温度30.49 ℃,获得原生质体产量为14.02×10⁶ CFU/mL,与理论产量(13.862×10⁶ CFU/mL)偏差小,可为后续原生质体融合育种和多样性分析提供重要基础。     

秀珍菇单孢子菌株原生质体制备条件的优化

以秀珍菇单核菌丝为材料,用溶壁酶进行原生质体的制备,考察各因素对原生质体产量的影响,用单因素试验和正交试验确定最佳条件。结果表明,菌龄为8 d菌丝体,0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L Tris-HCl为稳渗剂,酶解温度29℃、酶浓度1.6%的条件下酶解160 min。原生质体产量达到3.5×10~7 CFU/m L,原生质体再生率达到1.4%。     

桃褐腐病菌(Monilia fructigena)原生质体制备及再生条件

以桃褐腐病菌(Monilia fructigena)为供试菌株,研究了酶系组成、液体培养基、菌龄、酶解温度、酶解时间对原生质体制备的影响,以及等渗液、固体再生培养基、酶解时间对原生质体再生的影响。结果表明:Fries(1/2)液体培养基培养24h,在10mg/mL崩溃酶+5mg/mL纤维素酶+20mg/mL蜗牛酶+10mg/mL溶菌酶的混合酶液中28°C酶解4h为桃褐腐病菌原生质体制备的最佳条件。采用液体再生涂布平板法,以含Ca2+的STC为等渗液的液体培养基和含蔗糖及Ca2+的Fries(1/2)固体培养基为桃褐腐病菌原生质体再生的最佳条件。经过观察与测定,再生菌株保持了原有的培养性状和致病性,接种桃果实后发病率为100%。     

疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生

以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)为供试菌株,研究了菌龄、酶的种类及浓度、酶解时间、酶解温度和稳渗剂对原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,制备嗜热丝孢菌原生质体比较适宜的条件为:PDB液体培养基培养28 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,0.15 mol/L的溶壁酶,30℃酶解4 h。原生质体再生以0.7 mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。     

冬虫夏草原生质体形成和再生的初步研究

研究冬虫夏草菌丝体的菌龄、酶种类、酶解温度、酶解时间、pH、稳渗剂和几种再生培养基对原生质体形成和再生的影响。最佳条件为 :生长 6d的菌丝体 ,组合酶 (1%蜗牛酶 +1%纤维素酶 ) ,酶解温度 36℃ ,酶解时间 2 .5h,pH6 .4 ,稳渗剂 0 .4M甘露醇溶液 ,RM3再生培养基。在此条件下原生质体的形成为 2 .0 4× 10 9个 ml,再生率为 0 .0 91%。     

玉米大斑病菌原生质体的制备与再生*

以玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)0109—8为供试菌株,研究了菌龄、液体培养基、酶系统、酶解时间、稳渗剂对玉米大斑病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明制备玉米大斑病菌原生质体适宜的条件为：Fries液体培养基培养分生孢子24h,1％Lywallzyme、1％Drislase和1％S创5nailase3种酶溶液混合使用,酶解5h,0.7mol/L KCl为稳渗剂;原生质体再生以0．6mol/L蔗糖作为稳渗液为佳。     

竹黄菌原生质体的制备与再生分析

为了提高竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennings)中原生质体用于遗传转化时的转化效率,研究竹黄菌原生质体制备及再生的最佳条件,建立竹黄菌原生质体的高效遗传转化体系。本研究以竹黄菌为材料,采用正交试验分析方法,对影响竹黄菌原生质体制备及再生的主要因素,不同酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂及菌龄、不同再生培养基等进行了系统的研究。结果表明,以0.6 mol/L Na Cl为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在33℃条件下对菌龄为6 d的菌丝体酶解2 h,原生质体产量最高,达到10.57×10~6个/m L;以0.6 mol/L蔗糖为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在29℃条件下对菌龄为4 d的菌丝体酶解2 h,原生质体再生率最高,为0.293%;最适合竹黄菌原生质体再生的培养基是TB3再生培养基。     

姬松茸原生质体形成和再生的研究

报道了溶壁酶系统、酶浓度、不同菌龄、脱壁促进剂、渗透压稳定剂和酶解温度对姬松茸原生质体释放率及不同再生培养基、渗稳剂种类、菌丝酶解时间和单双层平板对原生质体再生的影响。结果表明 ,菌龄为3～ 5d的菌丝以 1.5 %溶壁酶、0 .5 %蜗牛酶和 0 .5 %纤维素酶组成的酶系统在 30℃以KCl为渗透压稳定剂时 ,形成率为 1.4～ 1.5ⅹ 10 7/mL酶液 ;以蔗糖为渗透压稳定剂 ,菌丝酶解 1.5～ 3h ,以SMY和MYP为再生培养基 ,姬松茸原生质体再生率为 1.1‰～ 1.3‰。     

羊肚菌原生质体制备与再生*

羊肚菌原生质体制备的最佳条件为以培养3d的菌丝体为材料,0.6mol/L蔗糖溶液为稳渗剂,1.5%浓度的溶壁酶30℃条件下酶解3个小时,可得原生质体产量最高为3.35×106个/100mg.以0.6mol/L的蔗糖溶液做稳渗剂,CYM再生培养基上得到原生质体再生率为0.171%.这一研究结果为羊肚菌通过原生质体技术进行菌株的遗传改良提供了重要技术参数.     

高效除藻真菌云芝F21a遗传转化体系的建立

以蓝藻高效降解菌云芝F21a (Trametes versicolor)为出发菌株,对其原生质体的制备、再生条件及限制性内切酶介导的遗传转化进行研究。结果表明：在PDA培养基上,28 ℃培养4 d的菌丝最适于原生质体制备; 0.6 mol/L KCl为最适等渗条件;30 ℃混合酶液（2% cellulase+2% snailase+2% lywallzyme）酶解4 h,原生质体产量达到2.375×10⁷个/mL,此时再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术可将质粒pAN7-1导入云芝F21a的原生质体,在含有150 μg/mL 潮霉素的RM培养基中能够获得再生菌株,PCR验证初步表明该质粒已经转入云芝F21a原生质体。连续传代转接显示,阳性转基因菌株外源基因可以稳定表达,本结果为研究真菌高效消除蓝藻的分子机制奠定基础。     

轮梗霉原生质体的制备*

本文比较了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解温度和时间等因素对轮梗霉原生质体得率的影响。结果基本获得了制备原生质体的适宜条件:用0.6mol/L甘露醇稳渗剂配制成的4%纤维素酶和0.5%蜗牛酶混合酶,35℃酶解培养了30h的菌丝1.0h,即可得到较高产量的原生质体。对该原生质体进行了再生实验,其再生率约为23.8%。     

灵芝原生质体制备、再生及融合的研究

报道不同菌龄、酶液浓度、稳渗剂对灵芝原生质体产率及不同种类、不同浓度的稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,诱变后具抗药性标记的“中国红灵芝”菌种（mH1）原生质体制备时菌丝最适菌龄为48小时,酶液浓度为3％,稳渗剂以0．6mol／L蔗糖为佳;诱变后具抗药性标记的“韩国红灵芝”（mK1）原生质体制备时菌丝最适菌龄为40小时,酶液浓度为1％,稳渗剂为0.4mol／L甘露醇时原生质体产率最高。mH1,mK1原生质体均以蔗糖作稳渗剂再生率较高,其最佳浓度为0．6mol／L。在该条件下mH1原生质体再生率为3．20×10-2,mK1为5．40×10-2。在此基础上,以30％的PEG作为融合诱导剂进行灵芝原生质体融合,并获得了融合子,融合率为140×10-2。     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。     

丝状真菌AL18的原生质体制备和再生条件的优化

目的:为了建立起产苝醌类光敏剂丝状真菌AL18原生质体制备和再生体系。方法:采用单因素实验法研究了预处理方式、渗透压稳定剂和酶解条件对原生质体制备率和再生率的影响。结果:原生质体制备及再生的最佳条件是用0.3%的β-巯基乙醇预处理15 min,酶解液以0.6 mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂,0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液pH值为5.8,纤维素酶:蜗牛酶=2:3,酶的总浓度为15mg/mL,36℃酶解2h;以0.6mol/L的蔗糖作为再生培养基的渗透压稳定剂。结论:原生质体的制备率和再生率可分别达到1.42×107/mL和3.2%。     

链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变

以链格孢菌Alternariaalternata菌株NEW为供试菌株,研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响。结果表明,制备链格孢菌原生质体比较适宜的条件为PD液体培养基培养20h,以0.7mol/LNaCl为稳渗剂、1%LysingEnzyme、1%Drislase和1%Snailase3种酶溶液混合使用,30℃酶解3h。对原生质体进行了限制性内切酶介导整合(REMI)转化,筛选到了链格孢菌弱致病突变株NEW001,为致病相关基因的标记和克隆打下了基础。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。