不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

经典饲养层细胞Wnt表达的差异及其对人胚胎干细胞Wnt/β-Catenin信号通路的影响

目的:研究比较三种经典饲养层体系使用的成纤维细胞中Wnt基因的表达,及其对共培养的人胚胎干细胞的影响。方法:PCR验证19种Wnt基因在三种不同来源饲养层细胞中的表达情况,q PCR验证各组共培养人胚胎干细胞的Wnt/β-Catenin信号通路相关基因表达水平,流式检测其在不同密度饲养层条件下的增殖分化情况。结果:在全部19种Wnt基因(Wnt1,Wnt2,Wnt2b,Wnt3,Wnt3a,Wnt4,Wnt5a,Wnt5b,Wnt6,Wnt7a,Wnt7b,Wnt8a,Wnt8b,Wnt9a,Wnt9b,Wnt10a,Wnt10b,Wnt11,Wnt16)的表达检测中,昆明白小鼠来源饲养层细胞表达其中的16种,ICR小鼠来源饲养层细胞表达其中的10种,人成纤维细胞来源饲养层细胞表达其中的10种;增加饲养层细胞密度能够不同程度活化Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的表达,并激活人胚胎干细胞中的负反馈机制;高密度小鼠饲养层条件促进人胚胎干细胞的分化,高密度人饲养层条件促进人胚胎干细胞的增殖和分化。结论:不同经典饲养层体系提供的Wnt环境不同,其培养的人胚胎干细胞状态也有差异。     

胚胎干细胞凋亡的研究进展

胚胎干细胞单细胞悬浮培养时会出现凋亡,而当聚集生长或在饲养层细胞上培养时则能抑制凋亡的发生.整合素参与介导胚胎干细胞与饲养层细胞之间的粘附,而钙依赖粘附素则参与介导胚胎干细胞之间的粘附.凋亡的发生与细胞色素C从线粒体的漏出密切相关,Bcl 2家族可以调节线粒体释放细胞色素C,因而参与凋亡的调控过程.     

饲养层细胞培养

饲养层细胞在胚胎干细胞培养过程中起重要作用。以原代小鼠成纤维细胞为例,介绍了饲养层细胞的分离培养和制备过程,并就饲养层细胞如何通过分泌LIF(leukemia inhibitory factor,白血病抑制因子)和BMP(bone morphogenetic proteins,骨形成蛋白家族)等细胞因子,维持胚胎干细胞的自我复制和未分化状态的分子机制作出概述。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞,制成饲养层,用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好,增殖快,易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好,当培养4~5 d时,其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后,各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

人胚胎干细胞在3种培养体系中的生长

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells.hESCs)的培养一直是干细胞研究的重要内容.用本实验室独立建系的两株hESCs,建立3种不同的培养体系:小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)做饲养层,永生化人成纤维细胞(immortalized human adult fibroblasts,HAFi)做饲养层,无饲养层条件培养基培养体系(condition medium,CM),观察在3种培养体系中,干细胞的增殖和分化情况.发现3种培养体系中的hESCs都可以表达一致的生物学特性,但也有不同之处,相对于CM干细胞在MEFs和HAFi饲养层体系的分化率低,增殖快;但MEFs来源于鼠类是异源细胞,HAFi虽不舍鼠源性成分却繁殖很慢;无饲养层的体系便于操作,无外源细胞存在.实验所得出的结果可以引导研究人员针对于临床、科研不同的需要,选择最适合的培养体系.     

Sertoli细胞饲养层对小鼠精原干细胞增殖的影响

摘要 目的 以小鼠睾丸支持细胞(Sertoli)为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(STO) 饲养层做对照,研究它对小鼠精原干细胞增殖的影响。方法 用无血清StemPro-34 SFM培养基培养2～5日龄小鼠精原干细胞,分别用相差显微镜观察,免疫组化法研究Sertoli饲养层对精原干细胞生物学行为的影响。结果 发现精原干细胞在Sertoli及STO两种饲养层上的一周内的生物学行为非常相似,但培养1周后,Sertoli细胞作饲养层的培养体系中保留的精原干细胞要比对照组明显增多,约有30%的精原干细胞能存活下来并能维持存活到60d以上。结论 Sertoli细胞作饲养层明显促进精原干细胞的更新增殖。     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础。方法比较小鼠胚胎干细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测。结果ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性。结论研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性。     

人胚胎干细胞传代培养及细胞化学染色特性

目的 体外建立人胚胎干细胞传代培养方法,研究人胚胎干细胞细胞化学染色特性.方法 以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养人胚胎干细胞,检测人胚胎干细胞、自发分化克隆及拟胚体的细胞化学染色特性.结果 人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传30代以上其形态保持不变;人胚胎十细胞碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性,自发分化克隆细胞阳性程度明显减弱;人胚胎干细胞形成的拟胚体碱性磷酸酶染色弱阳性,过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性.结论 小鼠胚胎成纤维细胞能支持人胚胎干细胞传代培养,细胞化学染色结果能初步鉴别人胚胎干细胞未分化特性.