永生化转基因成纤维细胞治疗帕金森病

将SV40大T抗原的基因（LTAg）转染大鼠原代成纤维细胞并筛选到永生化成纤维细胞（RFLT）,将此细胞皮下植入裸鼠和大鼠脑内均无致瘤性,植入脑内时LTAg基因即停止表达,3个月后取出细胞培养时LTAg基因又会重新表达,将RFLT细胞分别转入酪氨酸羟化酶（TH）、GTP环水解酶－1（GCH）的基因,筛选出稳定表达姝。混合培养的这两种细胞经HPLC－ECD法测出多巴胺（DA）,将它们移植入帕金森病（PD）大鼠模型可明显改善动物的旋转行为（近4个月）,在脑切片中观察到TH和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达产物,本细胞株的建立为人类PD的基因治疗提供了一种获得新的适用的效应细胞的方法。     

人羊膜上皮细胞移植及基因治疗帕金森病大鼠

观察人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell,HAEC及)人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF基)因修饰的HAEC在帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)模型大鼠脑内的长期存活和对旋转行为的治疗效果。用包装BDNFcDNA的慢病毒转染原代HAEC(HAEC/BDNF),HAEC/BDNF与HAEC分别植入6-羟基多巴胺损伤的PD模型大鼠纹状体内,观察动物的旋转行为,用免疫组织化学方法鉴定移植物在体内的存活。结果表明,治疗组PD大鼠的旋转行为改善明显达14周,HAEC/BDNF组能使恢复时间提前。免疫组织化学方法发现移植细胞在14周后仍有少量存活且部分表达BDNF、酪氨酸羟化酶,纹状体内星形胶质细胞增生。实验结果说明,HAEC和BDNF基因修饰的HAEC移植对PD模型大鼠的行为有一定改善,HAEC可以作为一种治疗PD的供体细胞。     

骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用

目的探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植到帕金森病（Parkinson’s disease,PD）大鼠毁损侧黑质内,PD模型大鼠的姿势不对称性和黑质及纹状体内酪氨酸羟化酶（tyrosinehy droxylase,TH）表达的改变,以及BM—SCs在大鼠脑内的存活、分化情况。方法黑质、前脑内侧束两点法注射6一羟多巴胺（6-OHDH）并行为学分析筛选PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为移植组和对照组。BMSCs移植术后4周和8周,观察大鼠姿势不对称性,免疫组织化学及免疫荧光显色方法检测黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达变化以及BMSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。结果BMSCs黑质内移植可使PD模型大鼠的转动频率由（10．62±2．97）r／min降至（4．65±1．08）r／min（P〈0．01）,显著增加毁损侧黑质TH阳性细胞数量和纹状体内TH阳性纤维密度。BMSCs在大鼠黑质内可以存活至少8周,部分细胞分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结论黑质内移植BMSCs对PD模型大鼠有一定的治疗作用。     

纹状体内移植胚胎干细胞来源的神经前体细胞可升高帕金森病小鼠纹状体内多巴胺含量

目的探讨胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的疗效及作用机制。方法以小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)建立PD小鼠模型;于体外将小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向神经前体细胞(neural precursor cells,NPC)方向分化,经PCR与免疫荧光染色分析鉴定后将高纯度的NPC移植入PD小鼠纹状体内,2周和4周分别取纹状体制作冰冻切片并进行免疫荧光染色,用高效液相色谱法测定纹状体多巴胺的含量;对移植后死亡小鼠,取其脑进行常规石蜡切片、HE染色。结果移植的NPC可在移植部位存活,并分化为表达酪氨酸羟化酶(TH)的多巴胺能神经元;高效液相色谱法检测显示,PD小鼠纹状体内多巴胺含量明显降低,移植NPC 2周后的PD小鼠纹状体内多巴胺含量较未移植小鼠明显升高,但仍低于正常对照小鼠;移植4周后PD小鼠纹状体内多巴胺含量与未移植小鼠接近;有18.75%的PD小鼠移植NPC后形成畸胎瘤而死亡。结论 ESCs来源的NPC移植因可补充病变处多巴胺含量而对PD有一定治疗作用。     

多巴胺能神经元的体外培养及其纯度鉴定

目的通过建立体外培养的多巴胺能神经元模型,应用于帕金森病(PD)的病因和发病机制等基础研究.方法用孕14d的胎鼠中脑嘴侧被盖部组织进行分散细胞原代培养,并用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色法鉴定其纯度.结果本实验可观察细胞历时20～30d的生长过程,并观察到细胞生长的第7～11d是细胞生长最旺盛的时期,最适宜加入处理因素观察细胞变化.培养10d的神经细胞进行TH免疫组化染色,可见胞浆被染成棕黄色的细胞遍布视野,阳性率达90%.结论体外培养的神经细胞可保持结构和功能上的某些特点,提供了体内生长过程在体外重现的可能,可广泛应用于PD病因和发病机制的研究.     

多巴胺合成相关酶基因联合治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的 利用骨髓间充质干细胞（MSCs）作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因：酪氨酸羟化酶（TH）、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC) 和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I (GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD) 模型大鼠。方法 首先用重组病毒AAV-TH、AAV-AADC 和AAV-GCH-I的上清液对MSCs进行体外感染;将携带有TH、AADC和GCH-I基因的MSCs移植到PD模型大鼠纹状体内,检测纹状体及黑质内多巴胺及其代谢产物的变化,并观察其行为学的变化,以评估上述基因对PD大鼠的治疗作用。结果 重组假病毒颗粒感染MSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和原位杂交的方法在移植后12w仍能检测到上述三种基因的表达。免疫荧光检测发现移植后12w MSCs在脑内存活良好;移植后4w、8w、12w行为学观察发现阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为较对照组LacZ基因移植组有明显改善（p<0.01）;移植后12w时三重基因移植组较双重基因移植组有明显改善（p<0.01）。移植后12w用高效液相色谱（HPLC）电化学法测定损伤侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3,4-二羟苯丙酸（DOPAC）的含量,三重基因移植组较hTH+hGCH-I基因移植组有明显增高（p<0.01）;三重基因移植组较hTH+hAADC基因移植组有所增高,但两组之间没有显著性差异。结论 基因工程改造的MSCs 在移植到PD模型大鼠脑内后可以很好地表达目的基因并在对动物行为学及生化方面改善的长期观察中发现三重基因联合脑内移植可能是比双重基因联合移植更佳的帕金森病基因治疗途径。     

BDNF基因工程细胞对帕金森大鼠纹状体多巴胺及其代谢物影响的研究

目的:观察经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)对帕金森病(PD)大鼠纹状体多巴胺(DA)及代谢产物的影响。方法:采用电穿孔法将pIRESneo-EGFP-BDNF转染至骨髓MSCs;制备PD大鼠模型,随机分为Sham组,PD组,MSCs组,脑源性神经生长因子(BDNF)组,经侧脑室移植MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓MSCs,术后2周,4周,8周,腹腔注射阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为;应用高效液相色谱测定各组大鼠纹状体内多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)及二羟苯乙酸(DOPAC)。结果:移植术后2周,4周,8周BDNF组、MSCs组大鼠与PD组比较旋转次数明显减少(P<0.05),以BDNF组改善更为明显。移植细胞干预PD模型8周后BDNF组、MSCs组大鼠纹状体DA、HVA、DOPAC较PD组明显提高(P<0.01),以BDNF组更为显著。结论:经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰的骨髓MSCs干预PD大鼠模型,显著降低PD大鼠纹状体内DA代谢率,提高DA水平,改善PD大鼠的行为能力。     

PD大鼠胼胝体和扣带胶质原纤维酸性蛋白的表达

目的观察不同病程帕金森病(PD)大鼠胼胝体和扣带胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。方法大鼠右侧前脑内侧束注射六羟基多巴胺制备PD模型。大鼠分为正常对照组,2周、4周和6周模型组。以酪氨酸羟化酶(TH)和GFAP抗体免疫组化阳性分别显示黑质的多巴胺能神经元、胼胝体与扣带处的星形胶质细胞。结果 2、4、6周模型组右侧黑质TH阳性细胞数较正常对照组均显著降低,而2、4、6周模型组之间无显著差异。正常对照组和4周模型组胼胝体和扣带处星形胶质细胞呈未活化状态,两组之间的GFAP表达强度和细胞密度均无显著差异。2周和6周模型组两部位星形胶质细胞呈活化状态,其表达强度和细胞密度均显著高于正常对照组和4周模型组。结论急性完全损伤PD模型大鼠注射侧胼胝体和扣带处GFAP表达随病程呈增高、降低和增高趋势。     

大鼠脑神经干细胞系(RNSC-FMU 1)的建立和鉴定

采用无血清培养液分离和培养新生SD 大鼠脑的神经干细胞,以机械分散的方法传代,成功地建立了大鼠脑神经干细胞系(RSNC-FMU 1)。该细胞系可在体外长期传代,至今已在体外连续生长超过21个月(>100代),保持了神经干细胞的特性和正常的核型,经诱导可分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,具有较旺盛的自新能力,倍增时间约为20h,并可冷冻保存,裸鼠体内移植证实其不具有成瘤性。该细胞系为神经干细胞研究提供了一个良好的工具。     

谷氨酸和MK-801对正常和帕金森模型大鼠纹状体内多巴胺代谢的影响

采用微透析和高效液相色谱一电化学(HPLC-ECD)技术研究了谷氨酸和MK-801对正常和帕金森模型人鼠纹状体内多巴胺代谢的影响。用微透析技术在大鼠纹状体内分别定位给以左旋多巴、L-谷氨酸和／或MK-801,同时收集透析液,用HPLC-ECD方法测定透析液中多巴胺代谢产物的浓度。微透析和HPL-ECD分析结果表明：纹状体内定位给以序旋多巴,正常大鼠和帕金森模型大鼠纹状体内多巴胺代谢产物的浓度均升高;纹状体内定位给以L-谷氨酸,可使正常大鼠纹状体内多巴胺代谢产物的浓度降低,但对帕金森火鼠模型纹状体内多巴胺代谢产物浓度的降低不显著;纹状体内定位给以MK-801,正常人鼠纹状体内多巴胺代谢产物的浓度升高：但对帕金森人鼠模型纹状体内多巴胺代谢产物浓度的升高不显著：纹状体内同时定位给以MK-80l和L-谷氨酸,可以有效防止L-谷氨酸所致正常人鼠纹状体内多巴胺代谢产物浓度的降低。结果提示,谷氦酸可以通过NMDA受体调节多巴胺的代谢。尽管非竞争性NMDA拈抗剂MK-801可以有效防止L-谷氨酸所敛正常人鼠纹状体内多巴胺代谢产物浓度的降低,但却不能有效地改善帕金森大鼠模型纹状体内多巴胺的代谢水平。因此存正常及帕金森病情况下,谷氮酸一多巴胺相互作用机制和MK-801改善帕金森病的机制还有待进一步研究。     

脂多糖对大鼠多巴胺能神经元毒性作用的研究

目的　建立新的帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD)动物模型 ,探讨其发病机制。方法　在大鼠脑黑质(substantianigra ,SN)内注射脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)后 ,按大鼠不同存活期用高效液相色谱 (HPLC)来测定脑内多巴胺 (Dopamine,DA)及其代谢产物的含量 ;用免疫组化法观察酪氨酸羟化酶 (Tyrosinehydroxylase ,TH)阳性神经细胞、小胶质细胞的形态及数量变化。结果　DA及其代谢产物的含量在LPS注射侧随时间不同有不同程度下降 ,于第 14天达到最低 (P <0 0 1) ;注射侧黑质TH阳性神经元可以达到全部消失 ,该处可见大量被激活并有形态改变的小胶质细胞。结论　LPS可导致大鼠黑质多巴胺能神经元的损害     

电针对帕金森病模型大鼠腹侧被盖区TH和nNOS表达的影响

目的观察不同频率电针对帕金森病（PD）模型大鼠腹侧被盖区（VTA）酪氨酸羟化酶（TH）和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响。方法将30只SD大鼠,随机分为5组：正常对照组,假手术组、模型组,PD模型低频电针组和高频电针组。采用右侧纹状体内注射6-羟基多巴胺（6～OHDA）制备PD模型,取合谷和太冲穴,分别给予低频（2Hz）和高频（100Hz）电针治疗。免疫组织化学方法观察VTA的TH和nNOS表达。结果与正常对照组相比,PD模型大鼠vTA的TH表达减少、nNOS表达增加,高频电针可增加其TH表达和降低nNOS表达,低频电针对其没有影响。结论高频电针治疗PD的机制之一可能是通过降低PD模型大鼠VTAnNOS表达,从而减少因NO的产生引起的TH标记的DA能神经元的死亡。     

电针足三里穴对糖尿病胃轻瘫大鼠延髓多巴胺能神经元和 星形胶质细胞活性的影响

目的:研究电针足三里穴对糖尿病胃轻瘫大鼠延髓多巴胺能神经元内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和星形胶质细胞内胶质原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)表达的影响。方法:32只实验大鼠分为空白对照(空白)组、糖尿病胃轻瘫模型(模型)组、模型组+电针足三里穴(足三里)组和模型组+电针非经非穴(非经非穴)组(每组8只)。模型制备采用腹腔注射5%四氧嘧啶和熟地灌胃诱导的方法。实验3周后取大鼠延髓进行抗TH和抗GFAP的单一和双重免疫组化染色,观察并记数TH和GFAP在延髓内的表达。结果:与空白组比较,各实验组TH阳性多巴胺能神经元和GFAP阳性星形胶质细胞集中表达于延髓迷走孤束复合体内,有明显的定位特点;高倍镜下观察到TH阳性神经元周围有大量GFAP阳性星形胶质细胞包绕。各组TH和GFAP表达以模型组最高;而足三里组TH阳性多巴胺能神经元数量明显减少(31.3±4.4→16.8±3.2),GFAP阳性产物表达明显降低(113.8±7.6→95.4±8.4),且它们之间有统计学意义(P<0.01);非经非穴组与模型组之间差异没有统计学意义。结论:针刺调节糖尿病胃运动功能障碍大鼠与其调控延髓多巴胺能神经元及其周围的星形胶质细胞功能活动有关。     

神经肽CRH对原代大鼠皮层小胶质细胞NO、TNF-α和IL-6释放的影响

目的:探讨神经肽促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)参与调节原代大鼠皮层小胶质细胞的激活。方法:取原代大鼠皮层细胞,体外培养10 d,纯化24 h后得小胶质细胞,采用ELISA和NO测试盒检测小胶质细胞激活后促炎症介质一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的释放。结果:10-15mol/L CRH明显促进原代大鼠小胶质细胞的促炎症介质NO,TNF-α和IL-6的释放。CRHR1特异性拮抗剂CP154,526可以阻断CRH诱导的小胶质细胞促炎症反应。结论:神经肽CRH通过CRHR1调节原代大鼠小胶质细胞的促炎症反应,CRH联合细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)可以增强LPS诱导的小胶质细胞NO,TNF-α和IL-6的释放。     

雌激素对6-羟基多巴胺损伤黑质多巴胺能神经元的保护作用

本研究以P50听觉诱发电位(P50 auditory evoked potential, P50)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)阳性细胞计数作为黑质功能和形态学指标,动态追踪研究雌激素对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)损伤黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元的作用.将大鼠分为4组:(1)正常雌性大鼠对照组;(2)单纯帕金森氏病(Parkinson's disease, PD)模型组;(3)双侧去卵巢PD模型组;(4)去卵巢回补3d雌激素的PD模型组.在大鼠清醒和安静的生理状态下连续14d记录黑质的P50,并检测黑质TH 细胞数目的变化.结果显示:单纯PD模型大鼠黑质P50的T/C值较正常雌鼠降低40.60%(P<0.01),其损伤侧黑质TH 细胞数目减少64.74%(P<0.01);去卵巢PD模型大鼠黑质P50的T/C值较单纯PD模型大鼠进一步降低45.88%(P<0.01),同时其黑质TH 细胞数目值也进一步减少57.26%(P<0.01),表明急性缺乏生理水平性腺雌激素将增大6-OHDA损伤黑质DA能神经元的程度,同时使黑质的感觉门控(sensory gating, SG)功能明显受损;去卵巢后回补3d生理剂量雌激素,可明显改善大鼠黑质的SG功能,提高TH 细胞数量(与去卵巢PD模型大鼠比较,P<0.01),其黑质损伤程度与单纯PD模型大鼠相当.以上结果提示,生理水平的雌激素具有提高黑质DA能神经元对伤害性刺激耐受性的神经保护作用.缺乏性腺源性的雌激素时,及时给予生理剂量的雌激素可以减轻神经毒素6-OHDA对黑质DA能神经元结构和功能的损伤.     

早期帕金森病大鼠胶质细胞免疫反应活性的改变及其意义

目的:观察早期帕金森病(PD)大鼠脑内胶质细胞的免疫反应活性改变。方法:采用6-羟多巴胺(6-OHDA)制备PD早期大鼠模型,实验动物分为早期PD组和对照组。实验动物进行阿朴吗啡诱发旋转运动测试后,进行迈步实验的测试。免疫组织化学观察早期PD发病大鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫反应活性改变。结果:早期PD动物在30 min内旋转次数小于7r/min,迈步实验中,与对照组相比,早期PD动物在左前肢从开始迈步至返回鼠笼所需要的总时间和所迈的步数没有明显差异;PD早期大鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫反应活性明显增高。结论:早期PD大鼠尽管行为学上没有明显异常改变,但其脑内星形胶质细胞和小胶质细胞出现异常改变,这可能参与早期PD大鼠发病过程。     

建立人源A2B5+/CD133–的胶质瘤亚群干细胞样细胞株的实验研究

胶质细胞瘤(GBM)是人类最常见的原发性脑肿瘤,并且是人类癌症中最致命的肿瘤之一。目前学术界普遍认为,胶质瘤细胞的异质性和耐药性一定程度上归因于胶质瘤干细胞样细胞的存在。该研究通过对胶质瘤组织进行原代培养、分选纯化、单克隆法成功建立A2B5+/CD133–胶质瘤细胞株SHG-ZW,再干细胞逆转培养成胶质瘤干细胞样细胞株SHG-ZWs。细胞免疫荧光检测SHG-ZWs显示,其高表达干性标记物A2B5、nestin、Sox2等,不表达CD133;体外二次球体形成表明,SHG-ZWs可以在体外进行自我更新,不断增殖;诱导分化后行免疫荧光,检测到SHG-ZWs可向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化;裸鼠体内移植瘤实验显示,SHG-ZWs具有成瘤性。该研究表明,可通过分选纯化、单克隆法从实体肿瘤中建立稳定传代的A2B5+/CD133–胶质瘤干细胞样细胞株,为胶质瘤干细胞样细胞的研究、人源GBM肿瘤组织原代培养以及胶质瘤干细胞样细胞的靶向性治疗提供细胞工具。     

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .体外感染实验的成功为进一步进行基因治疗动物实验打下了基础     

酪氨酸羟化酶和左旋芳香族氨基酸脱羧酶基因的细胞表达及活性检测

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建了重组逆转录病毒载体pLHCX／TH及pLNCX2／AADC,通过脂质体介导将带有目的基因的载体分别转到包装细胞PA317中,经筛选得到产病毒的细胞PA317／TH和PA317／AADC,采用免疫组化、原位杂交方法检测目的基因表达;细胞经裂解后进行的酶促反应产物多巴胺以高压液相电化学方法检测证明所克隆的T‘H及AADC基因具有功能活性;这两种基因工程改造细胞可以完成酶促动力学的功能,使L-dopa及多巴胺产生明显增加。本研究为用TH和AADC双基因对帕金森病进行基因治疗提供了一定的依据。     

长江江豚脐带永生化成纤维细胞系建立及细胞生长特性研究

取长江江豚(Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis)产后胎盘脐静脉, 经组织块培养, 差异贴壁法纯化, 构建长江江豚的原代细胞系; 经外源癌基因SV40 T antigens（猿猴病毒T抗原）转染构建稳定脐带细胞系, 并对长江江豚的永生化后的成纤维细胞的细胞形态、转染效率、生长曲线和活率等进行探究。结果表明: (1)原代脐静脉细胞大约14d从组织边缘分离, 20d形成单层, 细胞呈现典型的成纤维细胞状, 梭形、不规则星行或多边形。原代细胞传代14代后出现老化和凋亡。(2)通过SV40 T antigens转染构建的细胞系可传代40—50次, 证实转染SV40 T antigens后可增加细胞的增殖能力。(3)不同世代永生化的成纤维细胞复苏前后细胞活性并无明显差异, 复苏细胞活性在90%以上, 表明永生化后的细胞可以稳定保存。利用CCK-8法测得细胞的生长曲线呈现“S”型。(4)对永生化的细胞系进行后续基因表达尝试, 通过转染外源基因绿色和红色荧光蛋白, 转染外来质粒效率约为15%, 说明外源基因可以表达, 并能被成功检测。研究构建长江江豚的脐静脉来源的永生化后细胞系, 为江豚的其他组织细胞系建立以及江豚细胞库的建立提供基础, 成功对永生化后的细胞系进行外源基因的转染, 为以后深入长江江豚相关基因和分子机制研究打下基础。