新型冠状病毒基因组G-四链体结构的初步研究

21世纪以来,冠状病毒频频引起危害人类健康的重要传染病,其中包括2003年严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、2012年中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2),目前对这些病毒引发的疾病并无特效的治疗药物。G-四链体(G-quadruplex,G4)是在DNA或RNA的鸟嘌呤富集区形成的非典型二级结构,可存在于人类和病毒基因组中,G-四链体的不同位置对病毒复制和感染等过程发挥重要调控作用。本研究针对七种与人类疾病相关的冠状病毒以及与SARS-CoV-2同源性较高的三种蝙蝠相关病毒,通过全基因组序列分析潜在四链体形成序列(Potential quadruplex-forming sequences,PQS),结果发现,十种病毒中均存在一定数量的PQS基序,同时对SARS-CoV-2 G-四链体存在位置及形成潜力进行评估,并分析了不同变异株间G-四链体基序的保守性。本研究对SARS-CoV-2基因组中G-四链体进行初步预测与探讨,旨在为COVID-19治疗提供一种新的药物靶点,使其更好地应用于临床研究。     

G-四链体DNA结合剂研究进展

富含鸟嘌呤的单链DNA序列可以缠绕折叠形成G-四链体结构。人类基因组中有36,000个以上的DNA序列有潜力生成G-四链体,如端粒末端重复序列,以及c-myc、c-kit、bcl-2等原癌基因启动子区域。G-四链体是由四个鸟嘌呤之间通过Hoogsteen氢键形成G-四分体,相邻的G-四分体再通过π-π堆积作用,由糖-磷酸骨架相连而成。G-四链体DNA的形成有着重要的生物学意义,它和相关基因表达水平密切相关,诱导和稳定G-四链体结构就有可能抑制癌基因的转录和表达,引起肿瘤细胞生物学功能的紊乱,从而抑制肿瘤细胞的增殖。G-四链体结构作为新的抗肿瘤药物靶点引起了科学家的广泛关注,能够稳定G-四链体结构的配体包括二酰胺蒽醌类、苝类、阳离子卟啉类、金属配合物和天然产物等。本文对近年来以G-四链体为靶点的配体的研究进行了综述。     

不同G的四链体结构对DNAzyme活性的影响

富含鸟嘌呤的DNA序列在金属离子（通常是钠、钾离子）存在的条件下,可以形成稳定的G-四链体（G-quadruplex）。该G 四链体能够结合hemin（氯高铁血红素）形成具有过氧化物酶的活性的G四链体-hemin复合物DNAzyme。将这一原理联合滚环扩增技术可以对核酸进行可视化的检测。本研究旨在探索G-四链体-hemin复合物中,G-四链体结构以及两个G-四链体之间的链接长度与DNAzyme过氧化物酶活性之间的关系。实验分别选取了平行、反平行和混合结构的G-四链体,通过热差异光谱、紫外光谱、圆二色光谱对结构进行分析,不断加长链接序列并测定3种结构形成的DNAzyme活性,发现正平行结构的G-四链体具有更高的DNAzyme活性和更明显的可视化效果。综上所述,平行G-四链体结构可以用来满足裸眼可视化检测的需求,为无需复杂仪器的核酸检测奠定了方法基础。     

G- 四链体DNA 结合剂研究进展

富含鸟嘌呤的单链DNA序列可以缠绕折叠形成G- 四链体结构。人类基因组中有36,000 个以上的DNA 序列有潜力生成 G-四链体,如端粒末端重复序列,以及c-myc、c-kit、bcl-2 等原癌基因启动子区域。G-四链体是由四个鸟嘌呤之间通过Hoogsteen 氢键形成G-四分体,相邻的G-四分体再通过π-π 堆积作用,由糖- 磷酸骨架相连而成。G- 四链体DNA 的形成有着重要的生 物学意义,它和相关基因表达水平密切相关,诱导和稳定G- 四链体结构就有可能抑制癌基因的转录和表达,引起肿瘤细胞生物 学功能的紊乱,从而抑制肿瘤细胞的增殖。G-四链体结构作为新的抗肿瘤药物靶点引起了科学家的广泛关注,能够稳定G- 四链 体结构的配体包括二酰胺蒽醌类、苝类、阳离子卟啉类、金属配合物和天然产物等。本文对近年来以G-四链体为靶点的配体的研 究进行了综述。     

G-四链体核酸的生物学功能

G-四链体是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA折叠形成的高级结构。可形成G-四链体的序列在人基因组中广泛分布,涉及DNA复制、端粒维持、基因表达与调控以及遗传不稳定性等过程。研究发现有些化学合成的G-四链体序列也具有生物活性,如核仁素的核酸适体AS1411具有抑制恶性肿瘤增殖活性。G-四链体的生物学功能研究对于恶性疾病的发病机理和靶向治疗,以及设计开发核酸类抗癌药物有重要意义。     

G-四联体的生物学功能研究进展

G-四联体是一种特殊的核酸二级结构,广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中,如DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区(5'UTR)序列等。许多研究发现,G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组等生命过程中起着至关重要的作用。目前的研究主要涉及DNA中的G-四联体、RNA中的G-四联体以及人工设计的G-四联体寡聚核苷酸,本文将从这三个方面介绍G-四联体的生物学功能相关研究进展。     

结核分枝杆菌espK基因G-四链体核酸序列多态性与表达调控功能研究

DNA的G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含串联重复的鸟嘌呤(guanine,G)的核酸序列折叠形成的四链体螺旋结构,目前认为其与基因表达调控和基因组稳定性有关。已有研究表明,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的espK(Rv3879c)是构成ESX-1分泌系统的一个重要元件,其蛋白序列具有串联重复的GTPITP氨基酸序列多态性。本研究经核酸序列比对分析,确定该氨基酸序列多态性区域对应的模板链上存在G4序列,且该G4序列仅存在于结核分枝杆菌复合群。通过比对结核分枝杆菌临床分离株espK基因的核酸序列,发现espK基因的高频率G1573C突变位于G4序列。为研究该G4结构及基因表达调控功能,首先利用圆二色谱检测其核酸片段在钾离子存在条件下的光谱学特征,证实其可在体外形成具有顺式平行结构特征的G4,同义点突变G4会使其结构稳定性下降。采用重叠聚合酶链反应(overlapping polymerase chain reaction,overlapping PCR)构建含有G4突变的espK表达质粒,获得重组表达菌株。通过实时定量PCR测定espK重组表达菌株中基因转录水平变化,发现同义点突变G4后,其基因转录水平比野生型espK重组菌株提升 1.5 倍(P＜0.05)。此外,临床分离株中espK出现的高频率G1573C突变会破坏G4结构,但蛋白免疫印迹检测结果显示espK G1573C突变导致EspK蛋白表达水平上升。以上结果提示,espK的G4结构具有表达调控功能,该G4区域的序列多态性可能通过影响EspK表达水平来调节ESX-1分泌系统的活性。     

G-四链体结构的检测、功能及调控

G-四链体结构是近年来发现的特殊核酸二级结构,它在体内极易形成,分布十分广泛并且具有重要的生物学功能。研究者们已经在体外检测到G-四链体的存在并解析出其晶体结构,各种检测该结构的方法如特异性荧光探针、抗体等也不断被发现或合成。G-四链体不仅广泛分布于端粒、启动子区、外显子等具有重要功能的基因区域,在5'非编码区(5'UTR)、内含子区、3'非编码区(3'UTR)等也有广泛存在。相应区域的G-四链体参与到端粒延长、DNA复制、转录、减数分裂、基因重组等重要的生命过程,发挥抗肿瘤、抗病毒、抑制血管新生等作用。目前基于G-四链体结构的抗肿瘤药物已经进入临床试验阶段并取得了良好的疗效。G-四链体结构的内源性调节包括多种内源性蛋白以及碱基的甲基化等,维持其含量与结构的平衡状态。此外,外源性小分子也可对体内G-四链体的平衡状态发挥调节作用。本文将从化学、生物和医学的角度对G-四链体结构的检测方法及其特殊功能和调控进行系统的论述和展望。     

G-四链体在卵巢癌治疗中的研究进展

卵巢癌(ovarian cancer, OC)是最常见的女性恶性肿瘤之一,缺乏有效的治疗手段是导致卵巢癌高死亡率的主要原因之一。DNA G-四链体(G4)是富含鸟嘌呤碱基的一种特殊核酸结构,该结构广泛存在于端粒、原癌基因启动子等区域,是目前抗肿瘤药物设计的重要靶点。此外,有研究表明,DNA G4可能还存在于炎症基因的启动子区域,进而参与炎症反应的调控。鉴于炎症反应在卵巢癌进展中的重要作用,DNA G4在卵巢癌治疗中可能具有抗肿瘤、抗炎的双重治疗效果。该文重点综述了DNA G4及其稳定剂在卵巢癌治疗中的最新研究进展。     

G四链体结构及其稳态

G四链体(G-quadruplex)是一种由DNA或者RNA构成的非典型核酸二级结构,广泛存在于生物体内,调节基因转录、复制等功能。然而,在生物体中,具有G四链体的核苷酸序列特征的片段并不一定能够形成由Hoogsteen键连接的G四链体结构。多种因素能够调控G四链体结构展开-折叠动态平衡:阳离子能够促进G四链体结构折叠; DNA/RNA解旋酶、转录因子能使G四链体结构展开、分子伴侣可促进G四链体结构折叠;小分子配基能够稳定G四链体结构促进其折叠;互补配对碱基序列、loop区长度也会影响G四链体结构展开-折叠过程。本综述旨在阐述影响G四链体结构展开-折叠动态平衡的因素,并为以后研究G四链体的调控机制和方向提供思路和依据。     

G-四链体与配体相互作用的研究方法进展

核酸的G-四链体结构在原核生物和真核生物的基因组中广泛存在,并参与基因复制和重组、端粒延伸、基因表达调控等多种重要的生物学过程.G-四链体与配体如Telomestatin、TMPy P4、BRACO-19、RHPS4等的相互作用研究有助于阐明其生物学功能.G-四链体与配体分子间的相互作用研究应用多种分析方法,如硫酸二甲酯印迹、凝胶迁移、聚合酶终止实验等生物化学法,而现代分析技术包含圆二色谱、荧光光谱、荧光共振能量转移、核磁共振、X-射线晶体衍射等光谱法,以及表面等离子体共振、电喷雾质谱和毛细管电泳法等.本文综述了可与G-四链体结合的配体以及G-四链体与配体相互作用的研究方法,并对各种方法进行了比较.     

G-四链体功能性核酸在微RNA生物传感器中的应用

微RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码小RNA,在细胞增殖、分化及凋亡等生物过程中发挥重要调节作用，其异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。因此，对特定miRNA进行精准检测，有助于疾病的早期诊断与及时治疗。核酸生物传感器凭借化学性质稳定、设计简单、可编程性及易修饰等优点受到广泛关注。其中，G-四链体功能性核酸是一种富含鸟嘌呤的DNA通过Hoogsteen型氢键形成的特殊空间结构，因其可通过范德华力及疏水作用等相互作用力与卟啉、染料和氯化血红素(hemin)等小分子结合并增强其理化性质，而广泛应用于miRNA检测领域。目前，G-四链体常与核酸扩增或纳米信号放大技术联用以提高灵敏度，既可用于目标识别，又可辅助信号输出。本文首先介绍了G-四链体的结构及其荧光增强及过氧化物酶活性提升的机制；其次，依据上述特性分别论述了G-四链体与荧光配体结合构建miRNA荧光生物传感器的研究进展，以及基于G-四链体/Hemin的miRNA生物传感平台，在比色、电化学及化学发光检测中的应用进展；最后讨论G-四链体在miRNA检测领域所面临的挑战，并展望未来发展趋势，以期促进高灵敏度及特异性...     

G-四链体:核酸的“新”结构

<正>核酸(包括DNA和RNA)是体内最重要一类生物大分子,DNA主要作为遗传信息载体,而RNA则作为信息中介分子、调节因子和酶等发挥多重生物学功能。核酸分子空间结构形式复杂、可变,可采用多种构象,在体内DNA主要为双螺旋结构,而RNA采取单链为主局部双螺旋结构,此外还存在一些特殊结构,如Z-DNA和G-四链体(G-quadruplex)等,这些结构对保证基因组完整性、基因表达和调控都具有重要作用。由于结构     

色胺酮卤代衍生物的合成、抗肿瘤活性及其与G-四链体DNA相互作用研究

色胺酮(Tryptanthrin,Try)是重要的天然吲哚喹唑啉类生物碱,本文首次合成了2,8-二溴色胺酮(BrTry)及8-碘色胺酮(I-Try),并研究其抗肿瘤活性;以G-四链体DNA为靶点研究其作用机制。化合物与BEL-7404、Hep G2、NCI-H460、T-24等四种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性和HL-7702正常肝细胞株的毒性实验表明,Br-Try和I-Try表现出比Try的抗肿瘤活性有不同程度的增强,而对正常细胞毒性减弱的结果。Br-Try对BEL-7404、NCI-H460和T-24肿瘤细胞株表现出比Try和顺铂更强的抗肿瘤活性,IC50值在7.08~9.68μM,而I-Try只对Hep G2细胞株表现了比Try和顺铂增强的抑制活性,IC50值为15.78±0.33μM。初步的作用机制分析表明,三种化合物与G-四链体DNA有较强作用,以Br-Try最强。     

DNA鸟嘌呤四联体研究进展

鸟嘌呤(G)四联体(G-quadruplex,G4),是指在DNA或RNA链中,富含G碱基的区域通过Hoogsteen氢键配对使G环互联形成的一种四链二级结构。人和动物的研究结果表明,G4广泛参与了DNA复制、转录、翻译和端粒结构维持等一系列基本的生物学功能。相比之下,植物G4生物学功能研究严重滞后。综述了人和动物DNA G4的研究方法,生物学功能及其可能的作用机制等研究进展;总结了植物G4的研究现状及其可能的生物功能;最后展望了G4在人类疾病诊断和治疗,农用物分子育种等方面的应用前景。     

家蚕胚胎中胚胎发育因子基因BmEDFG4结构的验证及其结合蛋白的筛选

【目的】本研究旨在通过寻找家蚕Bombyx mori胚胎发育因子(embryonic development factor, EDF)基因BmEDF G-四链体(G-quadruplex, G4)结构的结合蛋白,进一步探究G4结构调控家蚕胚胎发育的可能作用和机制。【方法】通过圆二色谱(circular dichroism, CD)和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)验证G4序列在体外是否形成G4结构;通过启动子活性实验验证BmEDF启动子区G4结构对BmEDF的表达调控的影响;通过qRT-PCR检测BmEDF在家蚕胚胎发育各时期的表达量变化。通过EMSA联合质谱分析可能与BmEDF的G4结构结合的蛋白,然后将与G4结构结合的2个候选蛋白BmeIF4H和BmADDH分别进行基因克隆、表达和纯化,再通过EMSA实验分别验证候选蛋白BmeIF4H和BmADDH与BmEDF的G4结构结合与否。【结果】CD和EMSA实验都证明BmEDF的G4序列在体外可以形成G4结构。启动子活性实验表明BmEDF G4结构的存在对BmEDF转录表达具有正调控的作用。qRT-PCR结果表明BmEDF在产卵后120 h时表达量显著升高。经原核表达纯化,获得BmeIF4H和BmADDH重组蛋白。EMSA实验表明重组蛋白BmeIF4H在体外与BmEDF的G4结构结合,BmADDH不与BmEDF G4结构结合。【结论】家蚕胚胎中的BmeIF4H蛋白可能与BmEDF的G4结构结合。本研究为解析家蚕胚胎发育的DNA高级结构调控机理提供了实验证据。     

原核生物基因组DNA链组成的非对称性

迄今,已有60多个原核生物的基因组全序列被发表。我们因此有可能对它们基因组的构成有更深入的认识。绝大多数生物基因组DNA的G与C和A与T的含量相等^[1]。但是,在许多原核生物基因组的先导链和后随链内存在G与C或A与T分布的不对称(Gc shew或AT shew)、原核生物DNA链的非对称性表现在碱基、密码子和基因水平。     

细菌分类学中日益重要的DNA体外杂交方法

由于微生物分类学中日益广泛应用分子生物学和遗传学成就,例如DNA中G C克分子%、核甙酸序列的相似性和基因组大小等,使人们对微生物的认识从表型相似性逐步深入到遗传本质的相关性,从而探索其间的亲缘关系。DNA链由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)四种碱基和脱氧核糖及磷酸相连而成,其中碱基的组成和排列直接关系着决定性状的“遗传密码”。因此,这些测定项目是本质性的。从最近的     

基于G4-配体的DNA模拟酶在生物传感中的发展与应用

鸟苷酸-四联体DNA (G4 DNA)是由富含串联重复鸟苷酸(G)的DNA或RNA序列形成的G4片层,并堆叠而成一类独特的核酸二级结构。G4 DNA结合多种特异性配体可形成具有催化过氧化氢活性的G4 DNA模拟酶(G4 DNAzyme)。由于G4 DNAzyme存在着序列构成简便灵活、适合多样传感平台检测等特点,其在新型生物传感方法研发、医学检测新技术研究等领域中应用前景广阔。本文主要依据G4 DNA结合配体的不同,对近年来新发展出的G4 DNAzyme进行分类与回顾,归纳为含氯化血红素(hemin)的G4-Hemin DNAzyme与非G4-Hemin DNAzyme。前者是目前G4 DNA模拟酶的研究主流——本文主要归纳了G4-Hemin DNAzyme在金属阳离子、生物小分子及生物大分子的检测分析方向上所取得的重要研究进展,并阐述其在生物传感领域的影响和优势;后者中的配体则主要包括金属阳离子N-甲基吗啡啉(4-methylmorpholine,NMM)、硫磺素T(thioflavin T,ThT)及新型金属配体(Cu²⁺＼Ce^{3 +})等。本文归纳其构成多样的G4 DNAzyme在生物传感领域、医学检测方向的最新研究进展与应用实例。全文最后对G4 DNAzyme的未来研究方向,以及进一步提高其催化检测灵敏度和准确性的积极作用提出展望。     

线粒体DNA单体型M8a对转线粒体细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)单体型M8a对细胞线粒体能量代谢的影响,该研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导血小板–细胞融合技术,构建mt DNA单体型M8a和G2a转线粒体细胞(transmitochondrial cytoplasmic hybrid cell,cybrid)模型。后续运用Real-time PCR检测细胞mt DNA拷贝数和RNA转录水平,多功能酶标仪检测细胞活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),线粒体呼吸测定仪检测细胞内源性氧呼吸(oxygen consumption,OC)情况。结果表明,与G2a细胞相比,M8a细胞mt DNA拷贝数和线粒体轻链(L链)转录水平明显降低(P0.01),细胞基础耗氧量、ATP合成耗氧量、最大氧呼吸能力和MMP显著下降(P0.05),细胞ROS水平显著上升(P0.05)。mt DNA单体型M8a细胞的线粒体呼吸功能受损,可能增加了该单体型人群罹患2型糖尿病的风险。