红色毛癣菌菌株的特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种快速的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法。方法根据红色毛癣菌保守区域-真菌核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）设计特异性引物,采用上游：ITS19865＇GAC ACC AAG AAA AAA TTC TCT GAA GA3＇,下游：ITS24415＇GTC CTG AGG GCG CTG AA3＇为引物对45株红色毛癣菌、5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌菌株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果 45株红色毛癣菌均能扩增出目的片段,5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌均无目的片段扩增出。结论红色毛癣菌可用特异引物PCR方法快速鉴定。     

家庭内红色毛癣菌病患者间菌株差异性分析

目的用PCR技术比较分离自同一家庭红色毛癣菌病患者的菌株差异性,分析家庭内多发的红色毛癣菌病的致病菌株是家内相互感染,还是家外感染。方法以家庭内多发的皮肤癣菌病患者为研究对象,分离致病菌株并以传统方法鉴定菌种。再分别用随机扩增多态性DNA(RAPD)和巢式PCR特异扩增红色毛癣菌的串联重复亚元件(TRSS:TRS-1/TRS-2)产生的指纹图谱分析种内株间有无差异性。结果纳入实验的16株菌分离自8个家庭,用形态学等方法及种特异引物均鉴定为红色毛癣菌。RAPD显示4个家庭内的菌株间有差异性,TRS-1区PCR指纹图谱显示5个家庭内菌株有株间差异,TRS-2区能鉴定出2个家庭内菌株间有差异。综合各方法共区分出6个家庭内的菌株间有带型差异。结论该研究提示家庭内多发红色毛癣菌病从家外途径感染率高于家内感染。TRS-1区PCR指纹图谱对红色毛癣菌的菌株区分度高于RAPD,更适于红色毛癣菌株间分型。结合多种分子分型方法可最大限度发现不同菌株间的差异。     

皮肤癣菌体外蛋白水解酶活性测定

目的观察皮肤癣菌的体外蛋白水解酶活性;比较分离自不同感染部位的红色毛癣菌的体外蛋白水解酶活性。方法实验菌株包括来自不同感染部位的红色毛癣菌22株、须癣毛癣菌3株、犬小孢子菌5株,进行体外培养,并利用9-羟基乙酚噻唑标识的酪蛋白和酶标仪检测真菌细胞外蛋白水解酶的活性。结果须癣毛癣菌的体外蛋白水解酶活性高于红色毛癣菌和犬小孢子菌（P〈0.05）,而红色毛癣菌和犬小孢子菌之间无差异（P〉0.05）。红色毛癣菌的细胞外蛋白水解酶活性在分离自浅部感染部位的菌株之间无差异（P〉0.05）,但高于引起毛癣菌肉芽肿的菌株（P〈0.05）。结论不同的皮肤癣菌体外蛋白水解酶活性可能不同;分离自不同感染部位的同一菌种的体外蛋白水解酶活性也有可能不同。     

我国代表地区须癣毛癣菌复合体的分子鉴定与分型研究

目的对我国代表地区的须癣毛癣菌菌株进行分子再鉴定和分型研究。方法选取我国南北方8个省市地区经表型鉴定的须癣毛癣菌菌株47株,通过再培养形态观察、生理试验;PCR扩增核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)D1-D2区,测序后利用数据库进行序列比对,对须癣毛癣菌复合体进行再鉴定;PCR扩增rDNA非转录间隔区(NTS)的三个串联重复亚单位S0、S1和S2区,进行种内分型,并比较不同部位来源菌株型别的差异性。结果我国南北方8个省市地区47株须癣毛癣菌中3株鉴定为断发毛癣菌,6株鉴定为无性型苯海姆节皮菌,其余均鉴定为万博节皮菌中的亲人型趾间毛癣菌;三对不同引物扩增38株趾间型毛癣菌和2株苯海姆节皮菌NTS区,共产生28种特征性带型。带型和菌株来源及发生部位无相关性。结论我国分离自人类须癣毛癣菌复合体的主要组成菌种为趾间毛癣菌;ITS区结合LSU D1-D2区测序有助于鉴定须癣毛癣菌复合体至种水平;NTS区的三个串联重复亚单位所产生的特征性指纹图提供了一种快速、稳定的分子生物学种内分型方法,可应用于趾间毛癣菌感染的流行病学研究。     

红色毛癣菌临床分离株的菌落形态和镜下结构特征再分析

目的探讨红色毛癣菌的菌落形态和镜下结构特征以及与感染部位的相关性。方法采用传统培养方法对192株红色毛癣菌进行表型分型,选取其中39株在28℃、30℃、35℃3种温度孵育6d、10d、14d时观察菌落形态和生长速度。结果192株红色毛癣菌共分离出3种表型：绒毛型、沟纹型、粉末型（或颗粒型）。在相同培养基上,28℃、30℃时菌落生长速度无显著差异（P〈0.05）,均快于35℃（P〈0.05）。在相同温度时,菌落在SDA上的生长速度快于PDA培养基。在28℃、30℃时菌落形态比较稳定,在35℃时变异较大。菌落在PDA培养基上产孢丰富,镜下显示有较多的大、小分生孢子,而在SDA培养基上只有少量的小分生孢子,几乎见不到大分生孢子。各种浅部感染均以绒毛型为主,绒毛型在手足癣中占比例最高,沟纹型在体股癣中所占比例较高,粉末型在甲癣中占的比例较高。结论红色毛癣菌的菌落形态与培养基和培养温度有关,其表型和镜下结构与感染部位均有一定的相关性。     

红色毛癣菌蛋白酶MEP和SUB的表达及临床意义

目的探讨红色毛癣菌蛋白酶MEP和SUB的表达及临床意义。方法抽提红色毛癣菌总RNA,采用半定量RTPCR法检测红色毛癣菌金属蛋白酶(Metalloproteinases,MEP)、枯草菌素蛋白酶(subtilisins,SUB)基因表达量的变化。结果不同病例的红色毛癣菌SUB的表达水平与临床症状的严重程度密切相关,而与患者的年龄、性别、病程等无明显相关性;MEP的表达水平在不同年龄、性别、病程和临床分型等方面存在一定差异,但无显著意义。结论红色毛癣菌致病力的大小可能与SUB的不同表达有关。     

参照CLSIM38-A方案测定皮肤癣菌临床株对4种抗真菌药物的敏感性

目的测定并比较临床分离的皮肤癣菌对4种常用抗真菌药物的敏感性,探讨CLSIM38-A方案用于皮肤癣菌药敏试验的可行性。方法实验菌株为31株临床近期分离的皮肤癣菌。其中红色毛癣菌14株,须癣毛癣菌14株,犬小孢子菌1株,铁锈色小孢子菌1株,絮状表皮癣菌1株。4种抗真菌药物为益康唑、伊曲康唑、特比萘芬、伏立康唑。采用M38-A方案微量稀释法,并适当调整试验参数进行体外抗真菌药物敏感性试验。结果红色毛癣菌和须癣毛癣菌对以上4种药物的敏感性无明显差异。犬小孢子菌、铁锈色小孢子菌、絮状表皮癣菌对所有4种抗真菌药物的敏感性都低于红色毛癣菌和须癣毛癣菌。结论M38-A方案经过调整适用于皮肤癣菌药敏试验。     

610例浅部致病真菌分析

目的了解本地区浅部真菌病的致病菌菌种的分布情况。方法用沙堡琼脂培养基分离培养浅部真菌病的致病菌,并分析各年份菌种分离结果。结果共分离出6种610株致病菌,其中红色毛癣菌居首位,念珠菌居第2位,红色毛癣菌和念珠菌的分离率随年份有明显变化。结论红色毛癣菌居患者浅部真菌病致病菌首位,念珠菌也是重要病原菌,且病原菌分离率随年份有明显变化。     

阴囊皮肤癣菌病患者临床及 真菌学分析

目的探讨阴囊皮肤癣菌病患者的致病菌、临床特征、易感因素及治疗转归等相关因素。方法回顾性分析2007-2017年广州市中山大学附属第三医院经真菌学检查确诊的24例阴囊癣病例,分析患者一般资料、临床特征、发病相关因素、合并其他部位浅部真菌病情况、病原菌及治疗转归等情况。结果 24例阴囊癣患者均为青少年,平均年龄19.6岁,平均病程2.9个月。患者分离皮肤癣菌24株,其中石膏样小孢子菌15株(62.50%)、红色毛癣菌7株(29.17%)和絮状表皮癣菌2株(8.33%)。石膏样小孢子菌主要引起阴囊单纯性感染,临床表现为特征性的白色伪膜样斑片,而红色毛癣菌多引起阴囊及其他部位皮肤癣菌病。结论阴囊癣多见于青少年,石膏样小孢子菌为主要病原菌,其临床表现具有一定特征性。     

126例面癣临床因素及病原菌分析

目的探讨面癣的致病菌种、临床特点及发病相关因素。方法对126例面癣患者进行真菌分离培养鉴定及流行病学分析。结果面癣见于各年龄段,以11～30岁最多见。患病动物接触史、合并其他部位浅部真菌病史及糖皮质类固醇激素类药物外用史是面癣发病的重要危险因素。分离出皮肤癣菌108株,包括红色毛癣菌63株（58．3％）、犬小孢子菌25株（23．1％）、须癣毛癣菌18株（16．7％）和石膏样小孢子菌2株（1．9％）。结论面癣的发病没有年龄差异,患者可见于各个年龄阶段;面癣的常见致病真菌绝大多数为红色毛癣菌和犬小孢子菌,其发病可能与患者自体接种或接触患病动物相关。面癣容易被误诊,及时进行真菌镜检和培养是降低面癣误诊率的关键。     

1株致体股癣的颗粒型红色毛癣菌变种的形态学观察与基因鉴定

目的：探讨1株致体股癣的颗粒型红色毛癣菌变种的形态学特点及核糖体基因序列变化。方法1例体股癣患者皮损中分离出1株红色毛癣菌,观察形态学特点,并用PCR测定核糖体转录间区（ITS）、D1/D2区、非转录区基因序列（NTS区）内串联重复亚单位（TRS）。结果该菌株可产生鹿角形菌丝,大分生孢子有中空现象及单侧出芽产孢特征,可在42℃生长;ITS和D1/D2区基因测序鉴定为红色毛癣菌,但TRS-1和TRS-2基因序列分别有2个、1个碱基差异。结论该菌株可能是颗粒型红色毛癣菌的1个变种。     

不同地区浅部真菌病病原菌流行状况比较

目的了解近半年来华东、华南、华北地区浅部真菌病病原菌的种类、构成情况以及菌种变迁。方法以近半年来在上海、广州、北京3家教学医院皮肤科就诊的浅部真菌病患者为3个地区的代表,对具有典型浅部真菌病临床表现且真菌镜检阳性的患者进行致病真菌的分离培养。结果共分离出致病真菌926株,其中红色毛癣菌544株（58.7%）,念珠菌132株（14.3%）,犬小孢子菌119株（12.9%）,须癣毛癣菌23株（2.5%）,石膏小孢子菌16株（1.7%）。华东地区浅部真菌构成比复杂,华南及华北地区相对简单。结论不同地区浅部致病真菌菌种及构成比存在差异;三地红色毛癣菌均仍占优势;而念珠菌和犬小孢子菌所占比例有上升趋势。     

应用RAPD标记技术对树鼩遗传多样性的分析

目的建立树鼩RAPD（random amplified polymorphic DNA）遗传标记分析方法,了解中缅树鼩种群的遗传多样性。方法采用PCR技术对40条随机引物进行优化,筛选出能有效用于树鼩群体遗传分析的RAPD位点,对48只树鼩个体的基因组DNA进行PCR扩增,并应用Popgene 1.32与RAPDistance Package Version 1.04等软件进行数据处理,分析树鼩的群体遗传特性。结果20个RAPD引物共检测到113个位点,平均每个引物可扩增出5.65个位点,其中多态位点数为69个（占61.1%）。个体间的遗传相似系数平均为0.8307,个体间遗传距离在0.09-0.27之间,平均遗传距离为0.1693。雄性群体的遗传多态度（H0）（0.1864）略高于雌性群体（0.1470）,平均遗传多态度（Hpop）为0.1667;树鼩遗传多态度所占的比例在群体内为48.29%,而雌、雄群体间为51.71%。NJ法进行聚类分析得出T15、T33和T47号树鼩个体聚类成一大类,其余45只树鼩个体聚成另一大类,雌、雄个体呈相互交叉现象。结论实验所筛选的随机引物可有效用于中缅树鼩种群的遗传结构分析。本树鼩群体具有较好的遗传多样性。     

卡泊芬净、米卡芬净对8种皮肤癣菌体外抑菌活性的研究

目的评价棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净（caspofungin）、米卡芬净（micafungin）针对常见致病性皮肤癣菌的体外抗菌活性。方法参考CLSI制定的M38-A2方案。测定82株常见皮肤癣菌的最低有效浓度（minimal effective concentrations,MECs）。结果按照MEC90浓度从高到低,米卡芬净对紫色毛癣菌和断发毛癣菌的MEC90是0.25μg/mL;对犬小孢子菌、疣状毛癣菌的MEC90为0.06μg/mL;对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏小孢子菌、絮状表皮癣菌的MEC90均在0.03μg/mL。②卡泊芬净对红色毛癣菌、紫色毛癣菌和断发毛癣菌的MEC90为1μg/mL;对须癣毛癣菌、犬小孢子菌、石膏小孢子菌、絮状表皮癣菌和疣状毛癣菌的MEC90为0.5μg/mL。③根据中位数检验,米卡芬净对几种皮肤癣菌的MEC值均低于卡泊芬净的MEC值,统计学比较有显著性差异（P〈0.05）。结论米卡芬净和卡泊芬净对皮肤癣菌有较强的抑菌作用,米卡芬净的MEC值低于卡泊芬净。     

应用RAPD分子标记技术探讨3种石斛属植物的种间关系

采用RAPD分子标记技术,分析了金钗石斛、铁皮石斛和齿瓣石斛三种石斛属植物的种间关系。10个引物产生的113条DNA扩增片段中,106条（93.81%）具有多态性,利用113个RAPD标记,计算遗传距离,利用非加权组平均法建立聚类图。结果表明,RAPD标记技术较好地从分子水平揭示金钗石斛、铁皮石斛和齿瓣石斛三种石斛属植物的遗传背景、亲缘关系,并为后期在DNA水平上对药用石斛的开发利用提供资料。     

脓癣的发病情况和病原菌变迁:上海地区19年的回顾性研究

目的了解近19年间上海地区脓癣的发病情况、病原菌及其变迁。方法选取头皮屑及头发真菌直接镜检阳性和(或)真菌培养为皮肤癣菌者,记录其临床表现、感染方式及动物接触史等。结果头癣患者1 009例,其中男性437例,女性572例;年龄20 d～93岁,平均10.44岁;脓癣114例(11.30%),其中男性44例,女性70例。年龄20 d～68岁,平均10.60岁,5～10岁最多见(45.61%),其次为5岁以下儿童(31.58%)。感染方式:发内型48例,发外型66例。真菌培养阳性的脓癣95例,其中犬小孢子菌29例(30.53%)、紫色毛癣菌21例(22.11%)、须癣毛癣菌19例(20.00%)、红色毛癣菌15例(15.79%)、断发毛癣菌7例(7.37%)、石膏样小孢子菌4例(4.21%)。脓癣的发病呈上升趋势,须癣毛癣菌脓癣尤为显著。结论上海地区脓癣主要发生于10岁以内儿童,犬小孢子菌是最常见的致病菌,发外型感染较发内型多见。     

须癣毛癣菌的形态学及分子生物学鉴定

目的对临床上分离自人(36株)及狐狸(5株)的须癣毛癣菌菌株进行新的分类系统鉴定,并检测传统的分类方法是否能满足临床鉴定需要。方法①观察原鉴定为须癣毛癣菌菌株在沙氏培养基、1%蛋白胨培养基、溴甲酚紫乳固体葡萄糖琼脂培养基(BCP-MSG)和显微镜下形态学及尿素酶、毛发穿孔等生理学试验表现。②通过ITS区段和LSU区段分子生物学序列分析进行新的分类系统的菌种分型,并对传统形态学和生理学鉴定方法进行检测。结果①41株须癣毛癣菌形态学及生理学试验符合须癣毛癣菌(38株)和红色毛癣菌(3株)菌落的特点。②ITS区段序列分析发现ITS区段能将须癣毛癣菌和红色毛癣菌准确的鉴定到种,但无法明确其种内分型;而LSU区段序列分析可对36株(36/38)须癣毛癣菌有性型做出明确的鉴定。结论传统实验室鉴定方法仍具有其有效性及可靠性。通过分子生物学鉴定,临床分离的须癣毛癣菌皆为指(趾)间毛癣菌(38/38),而LSU区段的序列分析鉴定狐狸源性菌株皆属于本海姆节皮菌,有别于大多数人源性菌株有性型为万博节皮菌,对于须癣毛癣菌的菌种鉴定更优于ITS区段,但分子生物学试验还需结合形态学的观察,才能够对菌种做出正确的鉴定。     

汕头地区甲真菌病病原菌流行病学研究

目的了解近年来汕头地区甲真菌病病原菌的种类和构成情况,掌握流行病学资料。方法对2005年12月～2008年12月间来我院皮肤科就诊的214例甲真菌病患者进行病甲标本真菌学检查和分析。结果214例患者分离出163株致病菌。酵母菌居首位,占53．99％,其中自念珠菌占22．09％,近平滑念珠菌占17．18％,热带念珠菌占6．75％,其他酵母菌占7．97％;皮肤癣菌居第2位,占37．42％,其中红色毛癣菌占23．93％,须癣毛癣菌占12．27％,断发毛癣菌占1．23％;霉菌居第3位,占8．59％,以曲霉和青霉为主,分别占3．07％和2．45％。结论汕头地区近年来甲真菌病病原菌为酵母菌、皮肤癣菌和霉菌,其中以红色毛癣菌、白念珠菌、近平滑念珠菌和须癣毛癣菌最常见。