血清中甲_2巨球蛋白对胰蛋白酶抑制活力测定

甲_2巨球蛋白(简称α_2M)是存在于人和动物血清中一种广谱蛋白酶抑制剂。实验利用α_2M对蛋白酶的特殊抑制原理:α_2M通过包陷蛋白酶去抑制蛋白酶对天然蛋白质的水解作用,但不破坏蛋白酶活化中心,因而仍保留对小分子合成底物的水解,释放显色基团,在分光光度计上比色,达到测定目的。本实验用人和大鼠正常混合血清作样品,对实验方法和测定系统中选择样品和试剂量作较详细介绍。方法灵敏,血清量少。为实验室和临床检验提供测试方法。     

鲎试验测定内毒素的一步显色法

<正>本文介绍了使用单一混合试剂的终点法和LAL显色动力学法。该试剂可用缓冲液、鲎试剂和底物(显色鲎试剂)混合冻干或用市售的LAL凝胶试剂、底物和缓冲液(显色法、凝胶法通用)混合后立即使用。这种单一试剂既可用于显色动力学方法,也可用于一步终点法(规定孵育时间)。由于去除了许多步骤和技术误差,因此可极大地减少显色法的差异。本文对动力学法和终点法进行了详细地比较,单一试剂法也与传统的多试剂法进行了对比。     

芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质

【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究。【方法】利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛。【结果】克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达。重组酶AprG最适反应温度为50°C,最适反应pH为10.0。各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强。底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低。AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显。【结论】蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景。     

荧光胺的合成和应用

近几年来,在蛋白质化学研究中,分析微量化的重要方面之一是使用荧光方法。在氨基酸、多肽、蛋白质测定中,荧光胺(Fluorescamine)可与游离的氨基反应,产生荧光的物质,借此测定的灵敏度可提高达10~(-12) 克分子。荧光胺在柱层析、薄层层析中都可用来测定氨基酸和多肽;也有用作抗体荧光标记的荧光试剂。此试剂已有Hoffman-La Roche公司生产出售,由于此试剂价格昂贵,因而很多实验室都不能普遍使用。本实验室使用国内的现有试剂,参照了有关的方法尝试合成该试剂,现已初步合成。合成的试剂与进口的Hoffman-La Roche公司的产品作了比较,基本符合。并且就此试剂在溶液     

利用自制简易分光光度计定量探究影响蛋白酶活性的元素

描述了一种定量研究酶活性的实验装置和方案。用蛋白酶分解乳蛋白的反应代替原教材中的肝脏研磨液分解过氧化氢的反应，结合自制简易分光光度计，使定量研究酶促反应变得更简单可靠。在比色皿中测量酶与底物混合物的透光度随反应时间的变化曲线，实现蛋白酶活性的定量实时观察；定量研究相同时间、不同温度下酶与底物混合物的透光度变化，描述和交流温度对蛋白酶活性的影响。此外，探讨了进一步降低实验仪器成本的方案，以利于更多的学校进行操作和实施。     

以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶显色方法的研究

建立一种以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶的显色新方法。酯酶样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶用磷酸缓冲液漂洗约10min后,浸入含有0.002%靛酚乙酸酯的溶液显色5～10min,可显出清晰的蓝色酯酶带。先将酯酶凝胶板浸于有机磷农药溶液中,然后再用靛酚乙酸酯显色液显色,比较同工酶谱,从同工酶带由深蓝色变为浅蓝色的颜色变化,可以看出对有机磷农药敏感的同工酶所受到的抑制程度。     

蛋白质酸水解液用过甲酸氧化处理对胱氨酸的测定

<正> 蛋白质在酸水解过程中,其中的半胱氨酸和胱氨酸易受到氧化而破坏。特别是在用茚三酮显色反应来检测氨基酸的柱层析法中,半胱氨酸不与茚三酮产生显色反应,因而对它无法测定。所以在测定这两个氨基酸时,通常采用过甲酸氧化法。即用过甲酸将蛋白质中的这两个氨基酸氧化为半胱磺酸进行测定。但这一方法操作烦杂,其中的过甲酸不易除去,而会在酸水解过程中使     

响应面法优化火棘总酚含量测定方法

通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘总酚含量的定量方法。考察了福林酚试剂的浓度(mol/L)及用量、Na2CO3溶液的浓度(g/L)及用量、水浴时间及温度、待测液体系的p H值及乙醇浓度等因素对火棘总酚含量测定的影响。在单因素试验的基础上,进一步通过Box-Behnken设计优化火棘总酚的检测条件。结果表明,火棘总酚的最适检测条件为:1 m L适宜浓度的火棘总酚提取物,加入0.4 mol/L福林酚试剂5 m L,漩涡混匀后,加入170 g/L Na2CO3溶液1 m L,混匀后于34℃水浴反应40 min,冰水中快速冷却,室温条件下于765 nm波长测吸光度。该方法具有极好的重复性及重现性,1 h内检测稳定性高,回收率高达99.95%,测定时可忽略待测液体系p H及乙醇浓度的影响。该方法可推广应用于其它植物总酚含量的检测。     

卫星电视教学辅导

蛋白质是细胞内含量最丰富,具有极其重要功能的生物大分子。本章着重介绍蛋白质及其基本组成单位氨基酸的分解与合成代谢。生物体内具有各种蛋白酶,可以把蛋白质降解为氨基酸。以人和动物消化道中的蛋白酶为例,按其作用方式不同可以分为肽链外切酶,肽链内切酶及二肽酶。在这些酶的综合作用下,蛋白质水解成氨基酸,进入细胞内代谢。各种氨基酸虽侧链基团各不相同,但都具有氨基和羧基,因而具有共同的分解代谢途径——脱氨基作用与脱羧基作用。本章仅介绍氨基酸的共同的分解代     

变色酸显色法同时测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性

提出一个用变色酸-硫酸显色浊同时测定核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶活性的方法:RuBP羧化酶/加氧酶与底物作用后,用碱性磷酸酯酶将其产物水解生成乙醇酸和甘油酸,然后与变色酸试剂在1:5的体积比下,沸水浴中显色反应90min,乙醇酸与变色酸反应生成红紫色化合物,甘油酸生成淡棕色化合物,分别在573nm,745nm各有一特征吸收峰。根据A_(573),A_(745)与乙醇酸和甘油酸浓度间的函数关系式,求出RuBP羧化酶/加氧酶活性。     

不同温湿条件下贮藏的3种禾本科植物花粉的一些生理变化

测定了水稻、玉米和狼尾草花粉在低温(4℃),低湿(RH45％),低温(4℃)高湿(RH90％),高温(35℃),低湿(RH45％)和高温(35℃),高湿(RH90％)4种贮藏条件下的蛋白酶活性,蛋白质含量,游离氨基酸含量的变化,结果表明：在低温高湿条件下,蛋白质降解和游离氨基酸含量上升慢;在高温条件下蛋白质降解快,游离氨基酸含量迅速上升。3种植物花粉中,水稻花粉蛋白酶活性强,在贮藏过程中蛋白质降解速率和游离氨基酸含量上升快：狼尾草花粉蛋白酶活性低,在贮藏过程中蛋白质降解速率和游离氨基酸含量上升慢;玉米花粉的蛋白酶活性、蛋白质降解速率和游离氨基酸含量上升速率居两者之间。     

显色基质鲎试剂法在人血白蛋白热原检测中的应用

为了对显色基质法测定人血白蛋白中的内毒素含量方法进行探讨。以内毒素,鲎试剂及显色基质,在一定的条件下反应释放出对硝基苯胺(PNA),溶液呈现黄色,于波长545nm处比色读数,其产色深浅与内毒素浓度呈线性关系,从而定量测定出检品中内毒素含量。结果表明标准曲线的线性相关系数r≥0.98,人血白蛋白经3.3倍稀释后无干扰作用。显色基质法与家兔法比较,有灵敏、快速、能定量、重复性好的特点,可用于人血白蛋白内毒素含量的测定。     

用日立835-50型氨基酸分析仪分析还原糖

氨基酸分析仪在结构上与糖分析仪相似,本文仅讨论利用日立835-50型氨基酸分析仪分析还原糖。一、原理在硼酸缓冲液洗脱条件下,糖的混合物能够在强碱性阴离子交换树脂柱上得到分离。经分离的单一糖组分在98℃温度下,与2,2′-双金鸡纳酸盐试剂作用,生成蓝紫色的络合物。该络合物在波长562nm处有最大吸收,因此可用氨基酸分析仪检测器的570nm通道进行检出。检出信号经数据处理机处理,电传打字机打印出色谱图和分析实验报告。二、材料与试剂阴离子交换树脂Aminex A-28(美国Bio-RAD实验室);2,2′-双金鸡纳酸钠(美国Sigma     

混合醇体系中测定氨基酸的茚三酮光度法

氨基酸一般利用自动分析仪定量测定,但需高精密仪器,而基层研究单位一般难以采用,而且分析也不需要如此精密。利用茚三酮能够定量测定氨基酸,除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮形成黄色化合物外,其它所有氨基酸均与茚三酮反应形成蓝紫色物质,溶液颜色深浅与氨基酸含量成正比。据此本文对氨基酸的茚三酮光度法测定进行了研究和改进。在混合醇体系中以醋酸钠-醋酸为缓冲溶液,加入抗坏血酸以增加反应的灵敏度,100℃水浴20分钟完成显色反应。并对酸度、试剂用量、反应时间等因素进行了研究,拟定了用于混合氨基酸总量测定的操作程序。     

氨基酸的离子交换色谱(理论原理和实践)(续)

<正> 五、洗脱液中氨基酸的定量测定洗脱液中氨基酸的定量测定是根据洗脱液中各组分与各种显色试剂(见第一章)反应时产生的颜色强度借助光电比色计进行测量的。适合于此目的所有显色试剂中,象上面指出的最有效的是茚三酮。这种制备简单,使用方便,重复性好的茚三酮试剂由Moore 和Stein 首先提出。作为这种方法的还原剂采用氢化茚三酮—茚三酮的还原形。如所周知,在与氨基酸相互作用时茚三酮形成带颜色的物质—双配位茚酮胺(Ⅲ)和醛     

茚三酮与氨基酸显色反应再探

<正> 一、前言迄今为止,茚三酮与氨基酸显色反应的机理仍不十分清楚。尤其已报道的操作中,该反应对各种氨基酸选择性极低,因而使本法的应用受到了一定限制。此外,据文献报道:茚三酮与氨基酸显色反应不仅仅发生于α-氨基酸、对于β氨基酸、伯胺类等亦能进行;金属离子会干扰显色反应等。对茚三酮与氨基酸显色反应进行深     

比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用

基于Berthelot显色测定ω-氨基酸的反应 ,探讨了比色法快速测定谷氨酸脱羧酶活力的测定条件。结果表明 ,该方法灵敏度较高 ,重现性好 ,成本低 ,快捷 ,可替代氨基酸分析仪分析法。对乳酸菌谷氨酸脱羧酶提取液的适宜反应底物体系为 0.2mol LMacIlvaine ,pH4.7,内含 0.1mmol LPLP (5 磷酸吡哆醛 ) ,10mmol L底物L MSG (L 谷氨酸钠 )。 2 0 0 μL底物溶液和 1～ 1 0 0 μL酶液在 3 0℃反应 ,然后冰浴中加入 2 0 0 μ/L 0.     

应用蛋白染色剂考马斯蓝D—250测定蛋白质的方法

在生物化学的研究中,普遍应用Lowry的Folin酚试剂的呈色反应,测定酶制剂的蛋白含量。由于植物材料中常含有酚类化合物,或能与Folin酚试剂起呈色反应的物质,例如有酪氨酸或色氨酸基团的小分子,往往使蛋白质的测定值比实际的高。用者马斯蓝(Coomassie Brilliant Blue)对蛋白质的染色作用,已广泛应用于蛋白质分离的凝胶电泳技术中。近来,Bradford应用考马斯G—250(Coomassie BrilliantBlueG—250)与蛋白质束缚时产生的颜色反应,发展了一种蛋白质的快速测定方法,操作方便,再现性好,测定的浓度范围在0—1000微克/毫升。下面我们除介绍这一方法外,并应用这个方法与Folin酚试剂法,对     

黑斑蛙消化系统蛋白酶的活力

用福林 酚试剂法对黑斑蛙 (Rananigromaculata)消化系统蛋白酶的活力进行了分析。结果表明 ,黑斑蛙食道、胃、前肠、后肠、直肠和胰脏蛋白酶的最适pH值分别为 1 5、1 5、7 4、7 4、7 4和 9 6 ,最适温度分别为 55、55、50、50、50和 50℃。在各自最适pH值和最适温度条件下 ,各部位蛋白酶活力由高到低的顺序为 :胰脏 >食道 >胃 >前肠 >后肠 >直肠。文中对黑斑蛙蛋白酶的特性进行了讨论 ,并对蛙的人工养殖提出了几点建议     

酶促反应的“诱导契合-锁钥”模式

在酶学理论中,阐释酶识别底物专一性的代表性学说有"锁钥"和"诱导契合"模型等.作者此前研究了蚯蚓蛋白酶Ⅰ(Eisenia fetida proteaseⅠ,EfP-Ⅰ)的底物专一性,提出了"诱导契合-锁钥"反应模式.然而,采用EfP-Ⅰ建立的模式是否具有普遍的酶学意义需要进一步论证.以蚯蚓蛋白酶Ⅱ(Eisenia fetida proteaseⅡ,EfP-Ⅱ)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin,Sub)以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为材料,分别研究了底物反应后酶与其他底物的相互作用.结果显示,经过凝血酶底物chromozym TH(CTH)反应后,蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶与尿激酶底物(chromozym U,CU)的反应活性显著降低(P<0.05),表现出符合"诱导契合-锁钥"反应的模式.蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶先与CU反应后,却仍能与CTH反应,但后续不能与CU发生反应,仍然表现为"诱导契合-锁钥"模式.另外,丙酮酸反应后的LDH,对乳酸的反应活力显著降低(P<0.05),而乳酸反应后的LDH对丙酮酸的活性却无显著变化.这可能是丙酮酸诱导的LDH构象具有相对的刚性,而乳酸诱导的酶构象具有相对柔性所致.