建立胃癌实验动物模型方法的研究

目的通过对人低分化胃癌细胞系SGC-7901状态和接种细胞数目的研究,建立良好的皮下接种胃癌的动物模型。方法采用腹腔注射SGC-7901细胞,使裸鼠形成腹水;光镜及电镜观察细胞状态;将购买的SGC-7901细胞以及形成腹水后的肿瘤细胞分别以1×108、1×107和1×106个进行裸鼠皮下接种,每组接种5只。观察其肿瘤形成时间、大小、状态及病理学变化。结果SGC-7901细胞接种裸鼠形成腹水后进行培养的肿瘤细胞增殖状态发生改变;购买的SGC-7901细胞以1×108及1×107接种裸鼠,在第21天肿瘤组织中央均出现出血和坏死;1×106的裸鼠第21天未见肉眼可见的肿瘤形成。腹水培养的肿瘤细胞,接种1×108的裸鼠在第21天肿瘤组织中央可见大面积的出血和坏死;接种1×107及1×106的裸鼠在第21天均未见出血和坏死,接种1×107的肿瘤组织体积较大。结论SGC-7901细胞接种裸鼠形成腹水后的细胞,更容易建立SGC-7901细胞皮下接种的胃癌动物模型,其中以接种细胞数为1×107的肿瘤生长较好,更适用于胃癌的实验研究。     

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立荧光素酶标记人胃癌原位异种移植模型。方法将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入人胃癌MGC803细胞,建立稳定表达荧光素酶的细胞,将其接种裸鼠胃壁浆膜下,建立胃癌裸鼠原位肿瘤模型。用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并进行小动物超声影像和病理学分析。结果裸鼠原位成瘤率为100%,活体荧光成像观察发现在接种第7天,就可以观察到肿瘤发光。21 d后肿瘤进入对数生长期,28 d后肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势。超声成像发现小鼠胃部有直径为8.39 mm,面积为28.92 mm2瘤块。结论荧光素酶标记可以实时监测原位异种移植人胃癌生长状况。     

基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型建立

目的建立基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型,为胃癌的转移研究提供个体化动物模型。方法将胃癌新鲜的手术标本移植到裸鼠皮下,建立胃癌患者异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型。进一步通过手术将皮下瘤组织原位移植到裸鼠胃部肌层,连续观察裸鼠的体征状态,通过近红外荧光活体成像技术检测肿瘤转移的发生。解剖荷瘤小鼠,将肺部转移灶进一步移植裸鼠皮下获得实体瘤。HE染色观察原发瘤与转移瘤的结构特征,(short tandem repeat) STR分析原发瘤和转移瘤的遗传特性。PCR-Array分析转移瘤和原发瘤中转移相关基因的表达。结果成功建立胃癌PDX模型,移植瘤组织结构与患者保持基本一致;通过胃部原位移植发现编号C19751的小鼠发生肺和肝的转移。其中肺转移灶皮下移植后获得了实体瘤,STR分析显示原发瘤保持了与肺转移瘤一致的遗传特征。PCR-Array结果显示,与原发瘤相比,转移瘤中CXCL12,IGF1和MMP2基因表达均显著上调。结论利用临床肿瘤标本成功建立胃癌转移模型,为胃癌转移研究提供了良好的个体化模型。     

裸鼠人来源性子宫腺肌病造模方法的比较

目的通过不同的造模方法建立裸鼠人来源性子宫腺肌病模型,筛选出理想的造模方法,为研究子宫腺肌病发病机制及相关治疗方案提供理想的动物模型。方法将80只雌性裸鼠随机分为腹腔种植组、皮下种植组、腹腔注射组和皮下注射组,每组20只。各模型组分别采用不同造模方法建立裸鼠人来源性子宫腺肌病模型,术后4周观察移植物的体积及组织形态学。结果腹腔种植组建模成功率95%,皮下种植组建模成功率45%,腹腔注射法及皮下注射法成模率0%。结论腹腔种植法建立子宫腺肌病裸鼠模型成模率高,稳定性良好,是一种理想的人来源性子宫腺肌病动物模型。     

Snail基因及其蛋白、E-cadherin蛋白在胃癌中的表达及其临床意义

目的观察Snail mRNA及其蛋白、E-cadherin蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系,并探讨它们在胃癌发生、发展中的作用及其临床应用价值。方法收集96例手术切除胃癌标本,同时取80例癌旁组织作为对照。应用免疫组织化学S-P法检测胃癌组织、癌旁组织中snail蛋白、E-cadherin蛋白的表达;运用原位分子杂交技术检测胃癌组织、癌旁组织中Snail mRNA的表达。结果（1）Snail蛋白在胃癌组织阳性率（83.3%）显著高于癌旁组织（41.25%）（P〈0.05）;高、中分化组Snail蛋白阳性表达率显著低于低分化组（P〈0.05）;Snail蛋白的阳性表达率在乳头状腺癌、管状腺癌及低分化腺癌与黏液癌之间差异有显著性（P〈0.05）;Snail蛋白的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关（P〈0.05）,与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及临床分期无关（P〉0.05）;（2）胃癌组织中snail mR-NA的阳性率（76%）显著高于癌旁组织（30%）（P〈0.05）;高、中分化组Snail mRNA阳性表达率显著低于低分化组（P〈0.05）;Snail mRNA的阳性表达率在乳头状腺癌、管状腺癌及低分化腺癌与黏液癌之间差异有显著性（P〈0.05）;Snail mRNA的表达与浸润深度及淋巴结转移有关（P〈0.05）,与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、临床分期及远处转移无关（P〉0.05）;（3）E-cadherin蛋白在胃癌组织阳性率（37.5%）显著低于癌旁组织（100%）（P〈0.05）;高、中分化组E-cadherin蛋白阳性率显著高于低分化组（P〈0.05）;E-cadherin蛋白阳性率在乳头状腺癌、管状腺癌及低分化腺癌与黏液癌之间差异有显著性（P〈0.05）;E-cadherin蛋白的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、临床分期及远处转移有关（P〈0.05）,与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位均无关（P〉0.05）;（4）胃癌组织中snail mRNA和snail蛋白的表达呈正相关（r=0.594,P〈0.05）;Snail蛋白和E-cadherin蛋白的表达呈负相关（r=-0.234,P〈0.05）。结论（1）E-cadher-in蛋白低表达与Snail蛋白高表达可能是胃黏膜恶性转变以及胃癌发生浸润转移的重要生物学标志;联合检测E-cadherin蛋白与Snail蛋白对预测胃癌浸润转移有重要意义。（2）Snail蛋白可能在转录水平上调控E-cadherin蛋白的表达。     

胸腔原位种植与经左心室注射建立肺癌脑转移动物模型的比较

目的为研究肺癌脑转移机制提供一种可靠的造模方法。方法 18只BALB/c nude裸鼠随机分为2组,分别经胸腔原位种植与经左心室注射的方法,接种处于对数期生长的人肺腺癌PC-9细胞(1×106/0.1 m L),接种后观察裸鼠状态,在裸鼠出现严重恶液质时处死。解剖裸鼠,观察肺、脑、肝、肾转移情况;病理取材、HE染色观察。结果胸腔原位种植组:3周后,第4、6、9号裸鼠可见胸壁瘤结凸起形成,渐增大;裸鼠于第4~6周开始出现体重减轻,并逐渐出现恶液质,分别于第5~7周处死。开胸后见:胸腔广泛灰白色肿瘤结节、团块形成,双侧肋骨、胸膜、脊柱多发种植灶,双肺被侵蚀压缩,颜色苍白,形态改变。HE染色见:肺表面广泛种植瘤形成,与正常肺组织分界清楚;仅6号裸鼠出现脑转移。经左心室注射组:裸鼠于第3周开始出现体重下降,并逐渐出现恶液质,全部裸鼠于第4周处死。开胸后:除11、18号裸鼠胸壁见2~3个散在瘤结分布(直径约1~3 mm),其余胸腔视野正常;肺组织轮廓清楚,未见瘤结生成。HE染色见:9只裸鼠均出现大小不一的多发脑转移灶。胸腔原位种植组:脑转移率为11.1%;经左心室注射组:脑转移率为100%。结论经左心室注射建立肺癌脑转移动物模型的方法,较胸腔原位种植的方法保证了更高的脑转移率。     

两种方式接种肝癌模型的比较

目的观察直接注入法和瘤块种植法制作Wistar大鼠肝癌模型的差异。方法采用大鼠含有Walker-256肿瘤细胞的腹水离心洗涤后接种于另一组大鼠的后腿后外侧皮下,待肿瘤长到直径约为1．0em,取下肿瘤并切成1．0-2．0mm^3大小。然后将瘤块接种于15只大鼠的肝叶上;另一组（15只）按上述方式将癌性腹水接种于正常大鼠的肝叶上;两组均在第7天后采用CT和开腹后游标卡尺分别测量种植性肝癌的直径。结果腹水直接注射法与瘤块种植法的肿瘤成瘤率分别为：86．7％和80％,两者并不具有统计学意义（P〉0．05）。第7天时,直接注射法所形成肿瘤的直径大于瘤块种植法的肿瘤（P〈0．05）。但瘤块法所引起的腹腔转移的可能性要少于腹水直接种法。结论直接注射法和瘤块种植法制作大鼠肝癌模型均可以满足临床实验研究的需要,但直接注射法的成瘤时间短,腹腔转移可能性也大;瘤块种植法成瘤时间略长,但腹腔转移可能性少于直接法。     

静脉输注新型溶瘤腺病毒在体内复制活性与抑瘤的关系*

目的:观察新型溶瘤腺病毒M1在体内代谢的时间及对肿瘤生长的抑制作用。方法:建立人胃癌裸鼠原位移植瘤动物模型,在指定时间点处死动物,观察瘤体大小,分离原发瘤及转移瘤进行病毒滴度测定,采用免疫组化及原位杂交来检测病毒的分布和活性复制。结果:在人胃癌裸鼠原位模型上,M1经静脉输注后不仅分布于胃原发瘤,而且存在于转移灶,但用M1静脉内给药可以减缓肿瘤生长速度。结论:静脉内输注溶瘤腺病毒可以选择性的作用于肿瘤及转移灶,并发挥溶瘤和靶向灭活plk1的双重效应。     

胃癌患者Sox2蛋白和CTHRC-1蛋白的表达与肿瘤发展密切相关

本研究选取病理科收集的自2016年1月至2016年12月的90例术后胃癌组织标本(胃癌组)、45例癌旁组织标本(对照组),采用免疫组化染色法检测两组标本中的Y框蛋白(Sox2)、胶原三股螺旋重叠蛋白-1表达,并分析其与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度的关系,采用Spearman秩相关检验检测两种蛋白的相互关系,试图探讨胃癌患者癌组织中性别决定区Y框蛋白(Sox2)、胶原三股螺旋重叠蛋白-1(CTHRC-1)的表达及其相关性。研究结果表明:胃癌组的Sox2蛋白阳性表达率63.33%显著低于对照组的93.33%(p<0.05),胃癌组的CTHRC-1蛋白阳性表达率78.89%显著高于对照组的24.44%(p<0.05);胃癌组的Sox2蛋白阳性表达与胃癌的分化程度、发生淋巴结转移具有相关性(p<0.05);胃癌组的CTHRC-1蛋白阳性表达与胃癌的淋巴结转移、TNM分期、肿瘤浸润深度具有显著的相关性(p<0.05);胃癌组的Sox2蛋白与CTHRC-1蛋白呈显著的负相关表达(Spearman相关系数r=-0.322, p=0.002<0.05)。本研究的初步结论表明:胃癌组织中Sox2蛋白低表达和CTHRC-1蛋白高表达,并且与肿瘤发展密切相关,且二者表达呈负相关。     

胃癌中Fascin 表达与K-ras 突变情况及两者相关性的研究

目的：观察胃癌组织中Fascin 表达和K-ras 突变情况,并分析其与临床病理特征的关系,研究Fascin表达和K-ras突变之间 的相关性,探讨两者在胃癌浸润转移过程中的作用。方法：在108 例胃癌组织中采用免疫组织化学法检测Fascin 表达,采用DNA 测序法检测K-ras突变。结果：108 例胃癌组织中Fascin 表达率为25.00 %,K-ras突变率为11.11 %;胃癌组织中Fascin 阳性表达, 发生淋巴结转移组多于未发生淋巴结转移组(P＜0.05),发生远处转移组多于未发生远处转移组（P＜0.01）;K-ras 突变,发生远处 转移组多于未发生远处转移组（P＜0.01）;胃癌组织中K-ras 突变和Fascin 表达之间存在相关性,Fascin阳性比Fascin阴性的胃癌 组织更倾向于发生K-ras突变（rp=0.378,P＜0.01）。结论：在胃癌组织中K-ras 基因突变和Fascin蛋白阳性表达存在相关性,且与 肿瘤的转移有关。     

人胰腺癌裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和超声成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人胰腺癌细胞株Capan-2建立胰腺癌裸鼠移植模型,评价生物发光和小动物超声成像在移植瘤模型建立中的作用。方法将表达荧光素酶基因的真核表达载体转入人胰腺癌细胞Capan-2,将1×106人胰腺癌细胞悬液分别接种于裸鼠胰腺和右后肢皮下,使其成瘤。生物发光成像和小动物超声成像系统观察肿瘤的生长情况。结果肿瘤细胞原位移植成功率为75%,皮下移植成功率为100%。生物发光成像系统在肿瘤细胞原位接种第7天,可以观察到肿瘤发光;小动物超声成像系统在肿瘤细胞皮下接种第7天,可以测量肿瘤的大小,但在肿瘤细胞原位接种的第7天不能测量肿瘤的大小。另外肿瘤细胞在裸鼠皮下生长的速度比原位生长速度快3倍左右。结论生物发光成像系统更适用于肿瘤早期监测,为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制提供理想工具。     

人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型的建立

目的建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型。方法将1例人卵巢癌组织移植裸鼠,建立人卵巢癌裸鼠原代移植实体瘤模型的基础上,再将实体瘤皮下移植、实体瘤原位移植、实体瘤细胞移植裸鼠。观察裸鼠实体瘤生长和转移情况,称量其体重、子宫卵巢重、瘤重及瘤的大小,并作病理、电镜、染色体检查。结果成功地建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型,并已传至第18代,传代移植成功率100％,组织学和超微结构形态均证明该实体瘤保留了原人卵巢癌特征,有人卵巢癌染色体特征,并出现肝、脾转移。结论本研究建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型与人相似,通过18代传代和实验观察方法稳定可靠。为人卵巢癌的研究提供了理想的动物模型。     

Feasibility and limits of an orthotopic human colon cancer model in nude mice

We sought to develop an accurate colorectal cancer model in nude mice with stable local growth, tumor cell dissemination, and reproducible metastatic capacity. To this end, we orthotopically transplanted histologically intact human colorectal cancer tissue from 10 human patients into nude mice. After successful local tumor growth, tumor tissues were retransplanted as many as 9 times in serial passage. All specimens were transplanted using microsurgical techniques. Histologic, immunohistochemical, and polymerase chain reaction techniques were used to determine tumor growth rates and kinetics, development of regional lymph node and distant hepatic metastases, and the induction of minimal residual disease (MRD). Stable local tumor growth rates with variable growth kinetics were detected in 73.4% of all mice. The lymph node and hepatic metastasis rates were low, at 18.4% and 4.9%, respectively. MRD, as reflected by CK20 positivity of the bone marrow in animals with lymph node and hepatic metastases, was present in 22.2%. The orthotopic colorectal cancer model described here is feasible for the induction of reproducible local tumor growth but is limited by variable growth kinetics and the low rate of lymph node and hepatic metastases. Cytokeratin-positive cells indicative of MRD could be detected in the bone marrow of approximately 25% of the nude mice with metastases. The observed induction of MRD after orthotopic implantation of intact human colon cancer in animals with lymph node and hepatic metastases might be improved if established colon cancer cell lines were used.     

人肝癌裸小鼠常位移植实验研究

采用硫贲妥钠（３０ｍｇ／ｋｇ、３０％乙醇配制）麻醉和蘸上立止血（２５０ｋＩＵ／ｍｌ）的明胶海棉止血措施确保了人肝癌裸小鼠常位移植术能安全、可靠地进行。本中心建立的两株人肝癌裸小鼠移植瘤株（ＨＨＣ４、ＨＨＣ１５）已成功地移植于裸小鼠（ＳＰＦ级）肝脏内,移植瘤生长良好、传代稳定和持续分泌ＡＦＰ。荷瘤（ＨＨＣ１５）３～６周裸小鼠血清ＡＦＰ含量与瘤体积的增加呈正相关。常位移植前（７ｄ）裸小鼠皮下注射０．１ｍｌ０．５％ＣＣ１（Ｖ／Ｖ。橄榄油配制）能明显提高ＨＨＣ４常位移植的成功率（Ｘ２检验、Ｐ＜０．０１）;在微量ＣＣｌ４作用下,裸小鼠肝细胞受损伤,发生肝硬化,在此基础上所移植和生长的人肝癌常位移植瘤与大多数人肝癌病变发生的肝脏病理生理学特点相似,本模型的建立更适用于抗肝癌药物的模拟治疗和筛选。     

Silencing of Discoidin Domain Receptor-1 (DDR1) Concurrently Inhibits Multiple Steps of Metastasis Cascade in Gastric Cancer

Accumulating evidence suggests that a unique set of receptor tyrosine kinases, known as discoidin domain receptors (DDRs), plays a role in cancer progression by interacting with the surrounding collagen matrix. In this study, we investigated the expression and role of DDR1 in human gastric cancer metastasis. Proliferation, migration, invasion, and tube formation assays were conducted in DDR1-expressing MKN74 gastric cancer cells and corresponding DDR1-silenced cells. The effects of DDR1 on tumor growth and metastasis were examined in orthotopically implanted and experimental liver metastasis models in nude mice. The expression of DDR1 in surgical specimens was analyzed by immunohistochemistry. DDR1 was expressed in human gastric cancer cell lines, and its expression in human gastric tumors was associated with poor prognosis. Among seven gastric cancer cell lines, MKN74 expressed the highest levels of DDR1. DDR1-silenced MKN74 cells showed unaltered proliferation activity. In contrast, migration, invasion, and tube formation were significantly reduced. When examined in an orthotopic nude mouse model, DDR1-silenced implanted tumors significantly reduced angiogenesis and lymphangiogenesis, thereby leading to reductions in lymph node metastasis and liver metastasis. In a model of experimental liver metastasis, DDR1-silenced cells almost completely inhibited liver colonization and metastasis. DDR1 deficiency led to reduced expression of the genes encoding vascular endothelial growth factor (VEGF)-A, VEGF-C, and platelet-derived growth factor-B. These results suggest that DDR1 is involved in gastric cancer tumor progression and that silencing of DDR1 inhibits multiple steps of the gastric cancer metastasis process.     

人EGFR显性负性突变体抑制胃癌细胞促血管形成能力

目的探讨人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR))对胃癌细胞促血管形成能力的影响及其分子机制,并检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法选用2株人胃癌细胞,分为如下6组:SGC-7901及NCI-N87细胞未转染组(US组,UN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组,EN组),SGC-7901及NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组,DN组)。采用人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔结构形成实验检测体外促血管形成能力,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,建立人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,标本微血管密度(microvessel density,MVD)检测体内促血管形成能力,标本体积检测其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现HUVEC管腔结构形成抑制,培养液中VEGF水平降低,MVD计数降低,裸鼠皮下移植瘤体积变小。结论 DNEGFR可能通过下调VEGF分泌抑制胃癌细胞体外及裸鼠体内促血管形成能力,最终抑制裸鼠皮下移植瘤生长。     

两种人乳腺癌裸鼠移植模型的建立

目的建立简便的人乳腺癌裸鼠移植模型,并探讨其部分生物学特性。方法采用雌激素受体阴性的MDA-MB-231和SK-BR-3人乳腺癌细胞株,分别接种于10只裸鼠左侧腋窝皮下,移植细胞总数为1×107/只。观察肿块生长情况,第42天处死荷瘤鼠,切除肿块作病理切片。结果 MDA-MB-231接种后第5d在接种部位可见结节,成瘤率为90%（9/10）,接种42 d肿瘤体积426.6±333.8,瘤重0.417±0.276,病理学检查为浸润性导管癌;SK-BR-3接种后第11天在接种部位可见结节,成瘤率为80%（8/10）,接种42 d肿瘤体积357.5±246,瘤重0.325±0.167,病理学检查为浸润性导管癌。结论该方法建立的人乳腺癌裸鼠移植模型,皮下移植方法简单,易于操作,成功率较高,肿瘤可部分保持人乳腺癌生物学特性,为研究人乳腺癌提供了重要工具。     

Establishment of a Patient-Derived Orthotopic Xenograft (PDOX) Model of HER-2-Positive Cervical Cancer Expressing the Clinical Metastatic Pattern

Squamous cell carcinoma of the cervix, highly prevalent in the developing world, is often metastatic and treatment resistant with no standard treatment protocol. Our laboratory pioneered the patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model with the technique of surgical orthotopic implantation (SOI). Unlike subcutaneous transplant patient-derived xenograft (PDX) models, PDOX models metastasize. Most importantly, the metastasis pattern correlates to the patient. In the present report, we describe the development of a PDOX model of HER-2-positive cervical cancer. Metastasis after SOI in nude mice included peritoneal dissemination, liver metastasis, lung metastasis as well as lymph node metastasis reflecting the metastatic pattern in the donor patient. Metastasis was detected in 4 of 6 nude mice with primary tumors. Primary tumors and metastases in the nude mice had histological structures similar to the original tumor and were stained by an anti-HER-2 antibody in the same pattern as the patient’s cancer. The metastatic pattern, histology and HER-2 tumor expression of the patient were thus preserved in the PDOX model. In contrast, subcutaneous transplantation of the patient’s cervical tumors resulted in primary growth but not metastasis.     

抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤新生血管生成的影响

目的:检测抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤血管生成的影响.方法:建立裸鼠肝癌H22细胞原位移植瘤模型,随机分成生理盐水组(n=12)和抗体组(n=12).采用免疫组织化学SP染色法对两组肝脏移植瘤进行血管染色,观察其微血管密度(MVD)情况.结果:成功建立裸鼠H22肝癌原位移植瘤模型,HE染色显示肝脏移植瘤为肝细胞肝癌,免疫组化结果显示肝脏实体瘤内微血管密度抗体组较生理盐水组显著性减少(25.64± 1.53 vs 8.65± 1.79,P＜0.05).结论:抗VEGFR-2嵌合Fab抗体能够抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的血管生成.