嵌合抗体轻链基因在家蚕细胞中的重组与表达

用家蚕修饰型核多角体病毒为载体,在家蚕细胞获得人鼠嵌合的抗人小细胞肺癌抗体轻链基因的表达。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明了抗体轻链基因已组建家蚕病毒基因组中。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ和分析都检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中产生了人鼠嵌合的抗体轻链。     

抗人CD28单链抗体基因的构建及在BmN细胞和家蚕中的表达

采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。为便于表达产物的纯化,在CD28-ScFv的C端增加了6×Histag序列。通过脂质体介导法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,经空斑分析和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv。将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv感染BmN细胞和5龄家蚕,SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在分子量约为28kD处有一表达带。BmN细胞的表达始于24h,表达峰在72h,96h时表达量开始下降,而5龄家蚕的表达始于48h,表达峰在120h。结果证明,抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞和家蚕中得到了特异性表达。上述研究成果为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。     

抗品胚抗原单链抗休基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ,与修饰的家蚕核型多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡ ＳｃＦｖ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫,在两者中均得到了高效表达,产物分子量为２８ｋＤ,前者占细胞总蛋白的６％,后者为０．３ｍｇ／蚕。目的基因在家蚕细胞和     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

DC-SIGN蛋白在家蚕系统中的表达及生物活性研究

目的：构建人DC-SIGN基因片段的家蚕表达系统,进行目的产物表达、鉴定及生物活性分析。方法：从体外刺激分化的DC细胞中克隆出DC-SIGN cDNA,在家蚕表达载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点构建成重组质粒pBacPAK8-DC-SIGN,与线性化的Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,空斑筛选得到重组病毒Bm-BacPAK-DC-SIGN,重组病毒感染家蚕细胞BmN,Western blot检测表达产物;HIV-1包膜糖蛋白gp120与表达产物孵育检测其生物活性。结果：构建了稳定表达人DC-SIGN蛋白片段的家蚕杆状病毒表达系统;成功表达了DC-SIGN蛋白片段,且能特异性地与HIV-1包膜糖蛋白gp120结合。结论：成功地在家蚕杆状病毒表达系统中表达了人DC-SIGN蛋白片段,具有天然DC-SIGN蛋白样的生物活性,为其抗体制备及AIDS防治药物的研发奠定了基础。     

人血管抑素（k1—3）在家蚕细胞和幼虫中的表达及活性测定

将人血管抑素 (angiostatin)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体 pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK angiostatin ,并与被线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK angiostatin。DNA点杂交结果表明重组病毒基因组中含有血管抑素基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞 (2×10 6个细胞 /瓶 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞 (ECV30 4 )及体内鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管实验检测其抑制活性 ,测得血管抑素可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖 ,家蚕细胞的产物活性在表达 72h达到最高值 ,在 2× 10 6个细胞中的表达量约 2 2u ;在家蚕体内表达 14 4h生物活性达到最高值 ,表达量约 15 9u/ml。2 .5u/ml的血管抑素能使ECV30 4细胞在 2 4h发生明显凋亡 ;可使CAM新生血管化率明显下降。此外 ,用ELISA、Western印迹方法测定了表达产物的免疫反应性。     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素 11(hIL 11) 5 46核苷酸cDNA ,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL 11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒 (BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN ,获得了插入hIL 11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL 11基因片段 ,RNA斑点杂交表明hIL 11基因得到了转录。重组病毒感染BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹 ,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中 ,SDS PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带 ;采用IL 11依赖细胞株B9- 1 1 和MTT法测定表达产物的生物活性 ,表明hIL 11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

鸡贫血病毒VP1和VP1蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与CunI酶切线性化的亲本病毒Bm-Bacpak6DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCC－MSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒（Recombinant BmNP)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

人GDNF在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达

将人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经G418筛选得到多拷贝转化子,甲醇诱导表达。将人GDNF基因克隆入昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,与线性化Bm-BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经体内重组,筛选到重组病毒。用重组病毒感染家蚕幼虫,5d后收集血淋巴。SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了酵母培养上清液及家蚕幼虫血淋巴中含有GDNF蛋白。活性研究表明,甲醇酵母及家蚕幼虫表达的GDNF蛋白能促进多巴胺能神经元的存活和突起生长。     

Expression of EGFP-spider dragline silk fusion protein in BmN cells and larvae of silkworm showed the solubility is primary limit for dragline proteins yield

Spider dragline silk is a unique fibrous protein with combination of tensile strength and elasticity, but the isolation of large amount of silk from spiders is not feasible. In this paper, we used a newly established Bac-to-Bac/BmNPV Baculovirus expression system to express the recombinant spider (Nephila clavata) dragline silk protein (MaSp1) fused EGFP in BmN cells and larvae of silkworm. A 70 kDa fusion protein was visualized after rBacmid/BmNPV/drag infection by SDS-PAGE and immunoblotting analysis. Fusion protein expressed in the BmN cells probably occupied five percent of the cell total protein; In a silkworm larva, approximately 6 mg fusion proteins were expressed. Solubility analysis of the expressed spider dragline silk protein indicated that 60% fusion protein is insoluble. EGFP fluorescence showed that fusion protein is tend to form aggregate by self assemblage. The results indicated the solubility is the primary limit for spider dragline proteins yield. It also suggested that directly produce fibrous spider silk in the secreting-silk organs of the transgenic silkworm larvae might be a better method.     

家蚕动力蛋白轻链8基因克隆及其对重力的响应

克隆家蚕动力蛋白轻链8(dynein light chain 8, Dlc8)基因开放阅读框架并对其序列进行分析．探讨Dlc8基因在家蚕胚胎、头、丝腺、中肠、皮肤、血液、脂肪和马氏管等组织中的分布．在细胞水平,应用RT-PCR和实时定量RT-PCR方法分析大梯度强磁场(large gradient high magnetic field, LGHMF)重力模拟环境(0 g、1 g、2 g)对家蚕Dlc8基因表达的影响．在整体水平,应用实时定量RT-PCR方法分析Dlc8基因在家蚕胚胎反转期和整个胚胎期对LGHMF模拟失重环境的响应．克隆的家蚕Dlc8基因开放阅读框架长度为270 bp,编码89个氨基酸．家蚕Dlc8基因推导的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、果蝇(Drosophila melanogaster)、线虫(Caenorhabditis elegans)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、小鼠(Mus musculus)、人类(Homo sapiens)等6个物种Dlc8基因的氨基酸序列同源性分别为67%、96%、91%、95%、92%、92%．信号肽分析结果显示,该蛋白质为非分泌蛋白,不存在糖基磷脂酰肌醇锚定位点．家蚕Dlc8分子质量与等电点分别为10.34 ku和6.81．Dlc8基因在家蚕的胚胎、头、丝腺、中肠、皮肤、血液、脂肪、马氏管中稳定表达．在细胞水平,家蚕Dlc8基因表达对重力变化较敏感,对磁场变化不敏感．在整体水平,Dlc8基因在家蚕胚胎发育的不同时期对重力的响应不同．整个胚胎发育期Dlc8基因在模拟失重条件下表达量与对照组接近．家蚕Dlc8基因可以作为重力生物学效应研究的分子靶标．该研究为深入探讨家蚕Dlc8基因重力生物学效应机制奠定了基础．     

利用重组杆状病毒在家蚕中表达人血管内皮细胞生长因子

家蚕作为“生物工厂”生产重组蛋白质具有很多优势 .构建携带编码人血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 16 5个氨基酸的cDNA的重组杆状病毒 .将此重组病毒接种 5龄家蚕幼虫进行重组蛋白的表达生产 .时相表达分析表明 ,感染后大约 80h时表达水平达到最高 ,而且重组蛋白主要存在于血淋巴中 .从感染的幼虫收集血淋巴并用Nickle亲和层析纯化重组蛋白产物 .定量分析表明 ,每条家蚕幼虫的表达水平高达 4 2 6 μg左右 .通过细胞培养体外分析 ,发现与对照相比 ,加入纯化的重组VEGF(10ng ml和 10 0ng/ml)能够使人HUVEC细胞体外培养细胞数增加 1 8～ 3 3倍 ,说明家蚕幼虫表达的重组VEGF具有完全的生物活性 ,能够诱导内皮细胞在体外分裂增殖 .     

CHARACTERIZATION OF ADAPTOR PROTEIN COMPLEX‐1 IN THE SILKWORM,Bombyx mori

To investigate the function of adaptor protein complex‐1 (AP‐1) in the silkworm, we characterized AP‐1 in the silkworm by RNAi technique and co‐localization methods. As a result, AP‐1 was found to exist as cytosolic form and membrane‐bound form distinguished by phosphate status, showing molecular mass difference. There was relatively more cytosolic form of AP‐1 than its membrane‐bound counterpart in the silkworm. However, AP‐1 distributed predominantly as cytosolic form in BmN cells. Interruption of AP‐1 expression via DsRNA was more efficient in BmN cells than in the insect larval, which led to a tendency to dissociation between subcellular organelles like the Golgi apparatus and the mitochondria. Environmental condition changes like relatively higher temperature and treatment with dimethyl sulfoxide can lead to expression variance of AP‐1 both in mRNA and protein level. In BmN cells, both the heavy chain γ and light chain σ could clearly co‐localize with AP‐1 β, mostly forming pits in cytoplasm. Two isoforms of AP‐1 σ corresponded to distinct subcellular distribution pattern, possibly due to C‐terminal amino acids difference.     

家蚕类泛素化翻译后修饰蛋白NEDD8的cDNA克隆、表达分析和亚细胞定位

【目的】NEDD8是一种重要的蛋白质翻译后修饰蛋白,对底物蛋白的功能具有重要的调节作用。本研究旨在探索家蚕Bombyx mori中NEDD8的功能。【方法】利用RT-PCR技术,从家蚕Bm N细胞中克隆了家蚕NEDD8完整的开放阅读框。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测家蚕NEDD8在不同发育阶段、5龄第3天幼虫不同组织中以及Bm NPV感染Bm N细胞后的相对表达量。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV(B.mori nucleopolyherovirus)感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下观察NEDD8在细胞中分布情况,用GFP抗体进行Western blot验证。【结果】克隆获得了NEDD8基因。序列分析表明,家蚕NEDD8高度保守,与家蚕泛素蛋白氨基酸序列一致性最高。qRT-PCR分析结果表明,NEDD8在家蚕的不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低;在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天NEDD8的表达量开始逐渐增加,化蛾后降至低水平;在家蚕杆状病毒感染Bm N细胞的早期和极晚期NEDD8的表达量都有明显增加。GFP-NEDD8融合表达定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。【结论】NEDD8编码序列在物种间高度保守;NEDD8在家蚕幼虫头部中表达量最高,在化蛹阶段表达量逐渐增加;NEDD8在Bm N细胞内普遍存在并且可能与参与Bm NPV复制。本研究所得结果为进一步研究NEDD8在家蚕中的生物学功能及修饰底物蛋白的作用机制奠定了基础。     

拯救细胞系恢复重组家蚕核型多角体病毒包涵体实现外源蛋白在家蚕中产业化生产

构建家蚕Bombyx mori肌动蛋白（BmA3）启动子驱动的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）多角体基因（ph）和OpNPV极早期启动子（IE1）驱动的zeocin抗性筛选基因转座供体载体,与鳞翅目辅助转座质粒pie2piggyBac共转染家蚕卵巢细胞BmN,经200μg/ml zeocin抗生素筛选一个月,成功获得持续表达BmNPV多角体蛋白的稳定细胞系BmN-A3ph。多角体缺陷型重组病毒BmBac-GF P感染拯救细胞系BmN- A3ph, 细胞成功装配出病毒包涵体颗粒,其包装效率约为野生型病毒感染正常BmN细胞的8%。用拯救型包涵体病毒颗粒喂食家蚕幼虫进行复感染,结果表明稳定细胞系所包装的包涵体病毒与野生型病毒一样能够通过口服途径感染宿主,却并不在宿主体内形成包涵体,从而保证外源基因高效表达。拯救型包涵体病毒可望解决传统注射感染效率较低问题,通过喂食感染可促进杆状病毒介导的家蚕生物反应器产业化进程。     

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子(hEGF), 一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS-hEGF, 将该重组质粒与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 筛选获得重组病毒vBacPAK-SEGF, 用vBacPAK-SEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕, Western blot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12 kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23 mg/ 106细胞, 五龄幼虫中的表达量可达到82 mg/mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb/c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性, 结果表明表达产物能显著促进Balb/c3T3细胞的增值。另外, 研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增 加, 睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。