敲除里氏木霉hkmt基因可增强纤维素酶的酶活性和表达水平

表观遗传是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控等。在组蛋白甲基化修饰中,主要是组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase,HKMT）参与调控。有文献报道,HKMT蛋白的催化核心为SET结构域,它具有促进或抑制基因表达的作用。在里氏木霉(Trichoderma reesei)中,HKMT对纤维素酶基因的表达调控的机制尚不明确。本文阐述了以里氏木霉为研究对象,利用Split-Maker技术构建了组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T. reesei QM9414。经PCR及Southern印迹验证正确后,显微镜观察到T.reesei Δhkmt菌株菌丝较长,分支较多。检测到突变体菌株连续7d滤纸酶活（filter paper enzyme activity,AFP）和羧甲基纤维素钠酶活 (carboxymethyl cellulose sodium enzyme activity,CMCA)。结果分别比野生型菌株高出5.00 IU·mL^-1、15.00 IU·mL^-1。利用RT-qPCR检测到突变菌株纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达分别高出野生型4.51、3.87和2.51倍。通过对野生型菌株和突变菌株形态特征、纤维素酶酶活性、纤维素酶相关基因表达量的探索,为进一步研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶表达的影响提供了新思路和实验资料。     

敲除组蛋白去乙酰化酶基因hdac对里氏木霉纤维素酶表达的调控作用

[背景]里氏木霉(Trichoderma reesei)是木霉属中产纤维素酶最具代表性的真菌之一,表观遗传调控是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,组蛋白去乙酰化是其中一种。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责脱乙酰化,敲除去乙酰化酶基因可引起菌株孢子、菌丝及纤维素酶活性等的一系列改变。[目的]通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase,hdac)建立了里氏木霉hdac缺失突变株(T.reesei△hdac),以研究对纤维素酶基因表达的调控作用。[方法]利用Split-Maker技术构建了组蛋白去乙酰化酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T.reesei QM9414。经PCR及Southern blotting验证正确后,对突变体T.reesei△hdac连续7 d检测滤纸酶活(filter paper activity,AFP)、羧甲基纤维素钠酶活(carboxymethyl cellulase activity,CMCA),利用RT-qPCR检测纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达。[结果]突变体T.reesei△hdac两种酶活力均显著高于出发菌株,分别高出8.00、30.00 IU/mL。突变体T.reesei△hdac纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平分别为出发菌株T.reesei QM9414的6.50、6.01和4.51倍。[结论]里氏木霉中纤维素酶的基因表达明显受到组蛋白去乙酰化酶基因(hdac)的调控,这为研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶的影响提供了新的证据。     

沉默里氏木霉组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因对纤维素酶表达的影响

【背景】里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种比其他真菌小很多的多细胞真核微生物,在工业上受到广泛应用,而里氏木霉QM9414是目前研究最多基因产纤维素酶丰富的突变菌株。【目的】构建里氏木霉中组蛋白赖氨酸甲基化酶(Histone Lysine Methyltransferase)基因hkmt的siRNA沉默载体和过表达载体来降低或者增强hkmt在里氏木霉QM9414中的表达量,以分析其对里氏木霉纤维素代谢的调控作用。【方法】根据里氏木霉hkmt序列设计siRNA沉默片段并用反转录的方法获得过表达hkmt片段。将沉默片段和过表达片段克隆至里氏木霉组成型表达载体中,构建沉默hkmt的载体和过表达hkmt的载体,并将其转化里氏木霉QM9414。通过荧光显微镜观察重组菌的菌丝生长情况,此外对各重组菌进行纤维素酶的滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(Carboxymethyl Cellulose Enzyme Activity,CMCA)的测试;利用荧光定量PCR的方法检测hkmt、纤维素酶基因cbh1、egl1及木聚糖酶激活因子xyr1的表达量变化。【结果】通过使用荧光显微镜观察,发现沉默、过表达hkmt重组菌的菌丝形态均与出发菌株无明显差异。荧光定量PCR测定结果表明,沉默载体和过表达载体可以分别沉默和促进hkmt的表达。沉默hkmt重组菌株中FPA和CMC酶活力相比出发菌平均升高2.5倍。此外,纤维素酶相关基因和激活因子在沉默hkmt重组菌中的表达量均有所增加,但是在过表达hkmt重组菌株中以上相应指标均呈现相反的趋势。【结论】组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因表达产物负调控里氏木霉产纤维素酶基因的表达,这为提高里氏木霉产纤维素酶水平提供了参考,并为里氏木霉产纤维素酶的表观遗传调控研究提供了新的证据。     

里氏木霉组成型表达siRNA干扰cre1基因对纤维素酶表达的调控作用

使用组成型siRNA干扰载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1进行siRNA干扰以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。根据里氏木霉cre1基因序列设计siRNA干扰片段。利用里氏木霉组成型表达载体将干扰片段分别构建至里氏木霉cre1干扰载体并将其转化里氏木霉QM9414。分别在48和144 h对各转化子进行纤维素酶酶活力测试(CMC酶活力测试和滤纸酶活力测试)及利用qPCR检测相关基因的表达。在诱导144 h时转化子的两种酶活力平均约比出发菌株高出1倍。qPCR检测cre1基因的表达结果表明,转化子的cre1表达量比出发菌株平均降低约50%,而ace1基因表达量变化不大。其他纤维素酶相关基因的表达水平也均高于出发菌株。通过组成型表达siRNA干扰里氏木霉cre1基因可以明显调控纤维素酶基因的表达,为研究纤维素酶的基因表达与调控提供参考。     

里氏木霉绿色荧光蛋白表达载体的构建及功能鉴定

为了后续研究里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因的表达与调控,利用overlap PCR及分子克隆技术构建了含有Col E1原核复制起始位点、氨苄青霉素抗性、里氏木霉的丙酮酸脱羧酶启动子、丙酮酸脱羧酶终止子、潮霉素B抗性的筛选标记并能表达增强型绿色荧光蛋白(Zs Green)的表达载体p LXT-Zs Green。将该载体转化里氏木霉QM9414原生质细胞,使用潮霉素B筛选平板得到阳性转化子,随后使用荧光显微镜在488 nm激发光下观察菌丝,并随机挑取4个转化菌株进行Western-blot验证。结果显示,里氏木霉菌丝体可发出明亮的绿色荧光,而且Western-blot验证了该载体能够在里氏木霉中有效地表达增强型绿色荧光蛋白。上述研究表明,载体p LXT-Zs Green在里氏木霉中能够稳定高效地表达外源基因,为研究里氏木霉的基因表达调控奠定了实验基础。     

赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1与白血病的研究进展

表观遗传学是后基因组时代兴起的一门新学科,它使人们认识到包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA调控在内的修饰也可以记载遗传信息;并且许多表观遗传改变是可逆的,对表观遗传修饰和调控的研究已成为生命科学的热点和发展前沿。2004年发现的赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)是第一个真正意义上的组蛋白赖氨酸去甲基化酶,使人们认识到组蛋白甲基化是一个动态的过程,通过组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的相互作用,动态地调控基因转录的激活和抑制等生物学过程。这重新定义了组蛋白甲基化,同时也为进一步深入研究组蛋白修饰提供了新的途径。我们在此简要介绍LSD1的结构与功能、LSD1与白血病的关系,LSD1在白血病的发生和发展中发挥重要作用,是一个潜在的治疗白血病的靶基因。     

组蛋白甲基化及其与肿瘤间的关系

组蛋白甲基化修饰是表观遗传学的重要研究领域之一,主要可分为精氨酸甲基化和赖氨酸甲基化两种。越来越多的证据表明组蛋白甲基化功能异常与肿瘤的发生发展密切相关,而且这种甲基化修饰过程是可逆的。对组蛋白甲基化的进一步研究,不仅有助于深入了解基因表达、调控、遗传等生理机制,而且对于肿瘤等重大疾病的诊断、防治和预后判断有重要意义。本文对组蛋白甲基转移酶、去甲基化酶及其与肿瘤发生发展的关系予以综述。     

表观遗传与microRNA相互调控机制以及在抗肿瘤领域内的应用

DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传机制是恶性肿瘤发生发展的重要原因之一．然而近年来研究发现,microRNA表达水平改变也参与恶性肿瘤的形成．最新研究资料揭示,表观遗传可调控microRNA表达,而一些种类的microRNA也可调节表观遗传,并且二者之间相互作用可调控组织细胞内基因表达以及诱导体内恶性肿瘤产生．研究资料还显示,表观遗传主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式调控microRNA表达,而microRNA则通过调节DNA甲基化转移酶、维持细胞中DNA甲基化水平或改变组蛋白修饰等途径调控表观遗传．对microRNA与表观遗传之间的调控关系以及在抗肿瘤领域内的应用进行全面而系统的论述．     

里氏木霉RutC30常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选pyr4基因缺陷型菌株及转化系统的建立

以里氏木霉Trichoderma reesei重要工业生产菌RutC30为出发菌株,通过等离子体（ARTP）诱变筛选,以5-氟乳清酸（5-FOA）和尿苷（Uridine）进行筛选,获得一株pyr4基因缺陷株RutC30ΔU3。用含有野生型里氏木霉pyr4基因的互补质粒转化突变株,可回复野生性状。经测序发现其pyr4基因在核酸序列多个位点发生突变,其中包括两个错义突变和一个移码突变,从而导致乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶失活。经遗传稳定性研究分析,传代5次后仍保持良好的尿苷依赖性、去葡萄糖阻遏以及高产纤维素酶特性。经实验筛选获得了pyr4基因缺陷菌株可作为基因表达系统的受体菌株,建立了以尿苷营养缺陷为筛选标记的木霉转化系统。     

人工锌指蛋白介导调控的里氏木霉纤维素酶生产

里氏木霉Trichoderma reesei Rut-C30是目前研究最广泛的纤维素酶生产菌,选育高产纤维素酶的里氏木霉菌株有助于提高木质纤维素资源生物炼制的经济性。利用人工锌指蛋白文库转化T.reeseiRut-C30,筛选获得了两株高产纤维素酶的突变株T. reesei M1和M2,与出发菌株比较,突变株M1和M2滤纸酶活分别提高100%和53%,且M1突变株外泌蛋白量提高69%,M2内切纤维素酶活提高64%。实时定量PCR分析结果表明,与对照菌株相比,突变株M1和M2中主要纤维素酶基因转录均上调,但不同酶基因在两株菌中有不同的变化特征。此外,纤维素酶抑制转录因子基因ace1在两株突变株中都转录下调,而纤维素酶正调控转录因子基因xyr1仅在M1突变株中上调。以上结果表明,不同人工锌指蛋白对纤维素酶活性的影响具有多样性。对这些突变体中人工锌指蛋白靶基因进行深入分析,为进一步深入探究里氏木霉纤维素酶合成调控的机理,以及利用代谢工程选育更高效的产酶菌株提供了基础。     

Screening of some wild fungal isolates for cellulolytic activities

Six wild fungal strains, Trichoderma viride, T. harzianum, Gliocladium virens, Aspergillus terreus, A. niger and Tiarosporella phaseolina , isolated from decomposed jute stacks and diseased jute stem, were tested for their cellulolytic and hemicellulolytic activities and compared with T. reesei MCG 77. Filter paper cellulase production by all these wild strains were lower than those produced by T. reesei while some strains ( T. viride, T. harzianum and G. virens ) possessed carboxymethyl cellulase, β-glucosidase, xylanase and β-xylosidase activities comparable to T. reesei. A. terreus and A. niger produced 3·2 and 1·2 times respectively, greater β-glucosidase activity compared to T. reesei when grown on microcrystalline cellulose.     

利用红色荧光蛋白分析里氏木霉合成纤维素酶的机理

以红色荧光蛋白作为报告蛋白研究了里氏木霉的纤维素酶合成机理。构建了里氏木霉的表达盒,通过该表达盒使红色荧光蛋白的基因整合到里氏木霉的基因组DNA上,并受纤维二糖水解酶基因启动子的调控,得到重组菌株T.reeseiTR2。在不同的条件下培养T.reeseiTR2,红色荧光蛋白的表达情况可以反映在不同条件下里氏木霉合成纤维素酶的情况。在诱导的情况下,红色荧光蛋白随时间变化的情况与培养液中纤维素酶活性的变化相似,培养至36h后可以观察到荧光,并且不断增强,到菌丝自溶时荧光减弱。另一方面,诱导后里氏木霉菌丝的各个部位均可以观察到荧光,而且分布均匀,表明菌丝的各个部位在纤维素酶合成过程中所起的作用相同。在非诱导的情况下,培养时间较长时也可以观察到较弱的荧光,表明在此条件下里氏木霉仍可以合成少量的纤维素酶,这一结果为解释纤维素诱导里氏木霉合成纤维素酶的机理提供了另一个试验依据。     

Reidentification of cellulolytic enzyme-producing Trichoderma strains W-10 and G-39

Strain W-10, originally identified as Trichoderma koningii, and its supposed mutant G-39, published for production and gene expression of cellulase and xylanase, demonstrated morphological characteristics distinct from those of T. koningii, respectively. To clarify the identification derived from morphological characteristics, several methods were used, including electrophoretic karyotyping, internal transcribed spacer (ITS) analysis of rDNA, and polymerase chain reaction (PCR) fingerprinting using the universal primer L45. All the molecular characteristics showed that strains G-39 and W-10 were identical to T. reesei and T. longibrachiatum, respectively. The results strongly supported that T. koningii G-39 and W-10 should be reassigned as T. reesei and T. longibrachiatum, respectively. Strain G-39 should be considered a mutant from T. reesei QM9414 whose spores were contaminated with those of strain W-10 during a laboratory operation. According to this, we declare that T. koningii G-39 and W-10 must be renamed as T. reesei and T. longibrachiatum, respectively.     

Histone lysine methyltransferases and demethylases in Plasmodium falciparum

Dynamic histone lysine methylation, regulated by methyltransferases and demethylases, plays fundamental roles in chromatin structure and gene expression in a wide range of eukaryotic organisms. A large number of SET-domain-containing proteins make up the histone lysine methyltransferase (HKMT) family, which catalyses the methylation of different lysine residues with relatively high substrate specificities. Another large family of Jumonji C (JmjC)-domain-containing histone lysine demethylases (JHDMs) reverses histone lysine methylation with both lysine site and methyl-state specificities. Through bioinformatic analysis, at least nine SET-domain-containing genes were found in the malaria parasite Plasmodium falciparum and its sibling species. Phylogenetic analysis separated these putative HKMTs into five subfamilies with different putative substrate specificities. Consistent with the phylogenetic subdivision, methyl marks were found on K4, K9 and K36 of histone H3 and K20 of histone H4 by site-specific methyl-lysine antibodies. In addition, most SET-domain genes and histone methyl-lysine marks displayed dynamic changes during the parasite asexual erythrocytic cycle, suggesting that they constitute an important epigenetic mechanism of gene regulation in malaria parasites. Furthermore, the malaria parasite and other apicomplexan genomes also encode JmjC-domain-containing proteins that may serve as histone lysine demethylases. Whereas prokaryotic expression of putative active domains of four P. falciparum SET proteins did not yield detectable HKMT activity towards recombinant P. falciparum histones, two protein domains expressed in vitro in a eukaryotic system showed HKMT activities towards H3 and H4, respectively. With the discovery of these Plasmodium SET- and JmjC-domain genes in the malaria parasite genomes, future efforts will be directed towards elucidation of their substrate specificities and functions in various cellular processes of the parasites.