大肠杆菌表达的重组细胞色素P—450nor的分离纯化

用ＤＥ－５２纤维素柱色谱法和ＦＰＬＣ法分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌色素Ｐ－４５０ｎｏｒ，经梯度洗脱ＭｏｎｏＱ纯化后的ｆＲ．Ｐ－４５０ｎｏｒ为单一色谱峰，比活达５５．２０Ｕ／ｍｇ、纯化倍数约为１１００倍，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测为单一谱带。     

枯草芽孢杆菌C1—B941的D—核糖发酵中间试验

使用转酮醇酶变异株－枯草芽孢杆菌Ｃ１－Ｂ９４１进行了Ｄ－核糖发酵中间试验。３０００Ｌ发酵罐试验结果表明,发酵培养基中的葡萄糖浓度为１８％时,发酵周期约为６４ｈ,发酵转化率达３６．８４％,发酵液经离子交换树脂纯化后,可以直接用于生产ＶＢ２合成的中间体－Ｎ－Ｄ－核糖醇基－３,４－二甲苯胺。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的工程菌表达产物进行纯化,经过超声破碎,包涵体抽提,凝胶层析,复性,离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达９８％,比活性达１０００００００ｕ／ｍｇ。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P-450nor的分离纯化

用DE－52纤维素柱色谱法和FPLC法（fastProteinliquidchromatography）分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌细胞色素P－450nor（recombinant　fusariumoxvsporumcytochromeP－450nor,rF．P－450nor）．经梯度洗脱MonoQ纯化后的rF．P－450nor为单一色谱峰,比活达55．20U／mg,纯化倍数约为1100倍,SDSPAGE检测为单一谱带．     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ－干扰素产生菌SW－INF／DH5α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ－干扰素蛋白占菌体总蛋白的60％以上,20L发酵液可收获2kg(湿重)菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过Sephacryl S-200柱的纯化方法。简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中来采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经SDS－PAGE检测纯度达100％,核酸含量和热原均合格,A280／A260>1．5．比活性达1×10⁷IU／mg,总回收率达40％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上,重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体,８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白,每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性     

从感染TMV的番茄叶纯化胞外β—N—乙酰氨基已糖苷酶

番茄系统感染ＴＭＶ（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）诱导叶β－Ｎ－乙酰氨基已糖苷酶活性升高。番茄叶胞外提取液经冰冻干燥浓缩,－２０℃丙酮沉淀、ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｃＣ－２５离子交的层析,ＰＢＥ９４（ＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒＥｘｃｈａｎｇｅｒ９４,Ｓｉｇｍａ）聚焦层析和ＳＥＰＨＡＤＥＸｇ－１５０凝胶层析纯化,获得纯化的β－Ｎ－乙酰氨基乙糖苷酶。凝胶层析测得该酶的分子量为１４５ｋＤ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ     

精制狂犬病疫苗纯化方法的比较研究

地鼠肾细胞狂犬病疫苗原液经１００ ｋＤ 膜浓缩 ３０ 倍,分别选用（１）ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ离子交换层析法;（２）Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ－２００ ＨＲ 分子筛选层析法;（３）二次蔗糖等密度区带离心法对其进行纯化。用此三种方法各试制３ 批精制疫苗,结果表明,经ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ离子交换层析纯化后疫苗总蛋白含量减少９９％ 以上,抗原比活性提高１５９ 倍,抗原回收率达５０％ ,纯化疫苗以ＮＩＨ 法效力测定平均为５．４ ＩＵ／２ｍ ｌ;经Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ－２００ＨＲ 分子筛层析纯化后疫苗总蛋白含量减少 ９８％ 以上,抗原比活性提高４１ 倍,抗原回收率达６３％ ,纯化疫苗效力平均为６．２５ ＩＵ／２ｍ ｌ;经一次蔗糖等密度区带离心法纯化后疫苗总蛋白含量减少９８％ 以上,抗原比活性提高３２１ 倍,抗原回收率达４３％ ,纯化疫苗效力平均为６．１８ ＩＵ／２ｍ ｌ,三种纯化疫苗均符合Ｗ ＨＯ 规程要求。     

重组葡激酶的分离纯化

在构建出高表达,高活性的葡激酶工程菌株的基础上,对表达产物进行了分离纯化研究。经离子交换纯化后,纯度达８５％－９０％,回收率为５０％－６０％,经凝胶过滤后,纯度达９９％以上,回收率为６０％,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,相对分子质量为１５．５＊１０＾３,比活为１．０＊１０＾５,Ｎ端氨基酸序列与献报道的相符。     

螺旋藻β—胡萝卜素的分离提纯研究

研究了螺旋藻β－胡萝卡素的提取和分离纯化方法。用丙酮－甲醇（７：２,ｖ：ｖ）可快速彻底地将螺旋藻的色素抽提出来,再用乙醚和５％ＮａＣｌ水溶液分离纯化后,经紫外可见分光光度计扫描分析可知产品为纯度较高的β－胡萝卜素,β－胡萝卜素产量为６．７５ｍｇ／ｇ干螺旋藻,提取率为７５％。     

疏水层析纯化人重组白细胞介素－4

应用疏水层析对大肠杆菌表达的人重组白细胞介素－４（ｒｈＩＬ－４）进行了纯化,含有ｒｈＩＬ－４的包涵体,经洗涤、变性、复性后,以Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析,得到了高纯度的ｒｈＩＬ－４．纯度达９７％;回收率为３２％;比活性为２×１０~７Ｕ／ｍｇ,讨论了ｒｈＩＬ－４疏水层析的条件,并对不同的方法纯化白细胞介素－４进行了比较．     

β1—4半乳糖基转移酶检测方法的建立及动力学研究

本文分离纯化了人ＩｇＧ的糖肽，去掉末端大酸和半乳糖，，经解和荧光标记，用ＨＰＬＣ纯化了荧光标记的底物［Ｇｎβ１－２ｍａ１－６（Ｇｎβ１－２Ｍｄα－３）Ｍβ１－４ｎβ１－４Ｇｎ－Ｐａ］。     

新组合菌系SCB329—SCB933利用L—山梨糖发酵产生维生素C前体2—酮基—L—…

在分析了新组合菌系ＳＣＢ３２９－ＳＣＢ９３３发酵过程特征的基础上,对流加发酵工艺中的种子培养、ｐＨ、溶氧的控制,以及发酵液初始培养基中的Ｌ－山梨糖浓度和流加起始点进行了优化,获得了比分批发酵更为满意的结果：发酵最终总糖达１３％（ｗ／ｖ）左右,发酵周期４０￣５０ｈ,产２－酮基－Ｌ－古龙酸达１１５－１３０ｍｇ／ｍｌ,克分子转化率达８８ｍｏｌ％左右。     

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基的分离纯化和结晶

藻红蓝蛋白α－亚基具有儿可逆光致变色性质。采用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶过滤、ＦＰＬＣ－Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０柱层析等纯化方法,得到了电泳纯的藻红蓝蛋白α－亚基,光化学活性达９３％。在室温、避光条件下,采用悬滴汽相扩散法,得到了两种外形不同的藻红蓝蛋白α－亚基晶体,进一步证实了上述纯化方法的可靠性。     

质粒pcDNA3—HGF的大规模纯经制备研究

质粒ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒ＤＮＡ应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括：发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ捕获质粒ＤＮＡ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ精制质粒ＤＮＡ,所得纯超螺旋质粒ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ符合质量标准。该纯化制备方法避免使用动物源性的酶及有毒试剂。     

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B—R2—A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式,在Ｅｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原来似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％。经磺酸解,及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白,再经ＣＮＢｒ裂解后,进行还原重组,ＨＰＬＣ分离纯化等步骤,每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５纯化,得重组人胰岛素约２０ｍｇ,基氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性。     

重组人白细胞介素—2在离子色谱分离时的复性

采用ＨＰＩＥＣ应用ＣＭ交换柱分离纯化Ｅ．ｃｏｌｉ工程菌表达的ｒＩＬ－２,与空气氧化复性相比较,又有１倍以上的变性ｒＩＬ－２在色谱过程中得到复性,且溶液ｐＨ影响ｒＩＬ－２的复性和纯化效果：ｐＨ７．０时ｒＩＬ－２复性率高于ｐＨ８．０时,但纯度明显低于ｐＨ８．０时分离的ｒＩＬ－２。     

β—Agkistrodotoxin的聚全与异构体观察

中国泊浙产短尾蝮蛇突触前神经毒素经制备电泳被进一步纯化,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,观察到天然β１－ＡｇＴｘ以及经电泳纯化获得的碱溶β１－ＡｇＴｘ－ＯＨ成分在电科谱上出现的聚合谱带,然而这些聚合谱带的含量似并不随时程的延长而明显地增强,另经双向分析发现,无论是天然的β１－ＡｇＴｘ或经电泳经获得的碱溶β－ＡｇＴｘ－ＯＨ成分均含有三个具有不同等电点及不同含一比例的异构体谱带,天然β１－ＡｇＴｘ－ＯＨ成分     

猪肺源肝素的分离纯化及其成分鉴定

本文报告了从猪肺中用改进后的碱性氯化钠盐解法萃取的粗肝素为原料,以新型分离材料ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ分离纯化,并与ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０进行比较,前者使粗肝素比活由１３．９ＵＳＰ／ｍｇ提高到２０３．６４ＵＳＰ／ｍｇ（美国药典单位）,纯化系数达到１４．６５,回收率达８６．９３％,而通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０分离纯化后的肺肝素其比活性提高到１０２．１０ＵＳＰ／ｍｇ,纯化系数为７．３５,回收率为７２．２２％,其比活性、总活性回收率及纯化系数等,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ均优于ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０。纯化相当量粗肝素所需时间、次数亦大大减少,并用醋酸纤维薄膜电泳,高效液相色谱进行性质和纯化鉴定,用红外光谱进行基团分析鉴定。