南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化

[目的]建立适合南药益智的扩增片段长度多态性(AFLP)扩增体系来研究不同地理居群益智遗传多样性。[方法]利用植物基因组试剂盒法提取高质量的益智基因组DNA,采用单因素和正交试验对AFLP过程中的酶切和PCR相关影响因素进行优化,并对适合益智AFLP分析的引物组合进行筛选。[结果]实验结果表明最佳酶切反应体系:模板DNA 0.6μg,酶量20 U,酶切时间2 h;最佳AFLP-PCR选择性扩增反应体系(总体积为25μL):10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL,d NTPs 2μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,引物(10 pmol/μL)各2.0μL,Taq酶(5 U/ml)0.5μL,模板稀释25倍2μL。利用建立的最佳扩增体系从64对引物中筛选获得8对选择性引物适合益智AFLP分析。[结论]建立了稳定的AFLP-PCR体系,为研究益智遗传多样性的AFLP分析奠定了基础。     

南药益智ITS-PCR体系的建立与优化

为了建立适合南药益智的ITS-PCR体系来研究不同地理居群益智遗传多样性,本研究利用植物基因组试剂盒法提取益智基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验对ITS-PCR过程中的关键影响因素进行优化,并对ITS-PCR产物进行测序鉴定。实验结果表明最佳ITS-PCR反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,d NTPs 4 mmol/L,Mg2+0.5 mmol/L,引物2.0μmol/L,模板20 ng,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL;最佳扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共32个循环;最后72℃延伸5 min。采用该最佳体系对益智基因组DNA进行PCR扩增,获得扩增产物经单向测序获得了益智ITS部分序列。建立了稳定的ITS-PCR体系,为研究益智遗传多样性分析奠定了基础。     

葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

本试验利用L16(45)正交试验设计探寻葡萄SRAP-PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化.充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系.结果表明Mg2+浓度为影响葡萄SRAP-PCR反应的关键因素:优化的20 μL SRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为:10×Buffer 2.0μL,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,引物0.4 μmol/L,DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 1.0 ng/L.利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对.本研究建立的适于葡萄SRAP-PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础.     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2+2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

白木香SRAP-PCR反应体系的建立

本实验对白木香SRAP-PCR反应体系的影响因素(模板DNA,Taq 酶,Mg2+,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP-PCR反应的最佳体系(20 μL):模板DNA 50 ng、引物0.30 μmol/L、Mg2+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.4 mmol/L和Taq DNA聚合酶1.0 U.适用于白木香的SRAP-PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序.     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明:CTAB法提取效果较佳.在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10 μL体系中含有1 μL10×PCR buffer,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP 100 μmol/L,引物0.3 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U和50 ng模板DNA.利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物(落羽杉和墨杉)及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究.     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(N.lutea)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究.获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10 μL反应体系:模板DNA浓度为50 ng、1μL10×Buffer、MgCl2浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U、正反向引物浓度均为0.8μmol/L.为检测该优化体系的稳定性,进一步选取16对引物组合对88份花莲核心种质进行PCR扩增,获得了183条清晰的谱带,其中165条具有多态性,比率为90％,说明建立的莲SRAP反应体系是稳定可靠的.莲SRAP-PCR反应体系的优化和建立,为利用SRAP标记技术深入开展莲的遗传多样性评价、遗传连锁图构建和分子辅助育种等研究提供成熟的技术体系支撑.     

SRAP分子标记技术分析鱼腥草居群的遗传多样性

在正交设计对鱼腥草SRAP—PcR反应体系进行优化的基础上,分析鱼腥草居群的遗传多样性的结果表明：最佳的SRAP-PCR反应体系为每10μL溶液中含有0．2mmol·L-1 dNTPs、20ng模板DNA、30ng·μL -1引物、0．5UTaq聚合酶和2mmol·L-1 MgCl2;最佳的复性温度和循环次数为53℃和35次;从340个引物组合中筛选出条带清晰、多态性好的118个引物组合,并扩增出7582个谱带,多态性谱带有6590个,多态率为86．92％;在这些谱带中发现19条特异性的谱带,其中居群ZY42占31．58％;聚类分析结果显示鱼腥草居群存在非常丰富的遗传变异。     

马铃薯SRAP-PCR反应体系优化及验证

为建立马铃薯最佳的SRAP-PCR反应体系,以马铃薯基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验相结合的方法,对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素(引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量、d NTPs浓度和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,建立马铃薯优化的SRAP-PCR反应体系。结果表明:马铃薯SRAP-PCR最佳反应体系中模板DNA用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为0.75 U。各因素对扩增结果影响依次是:Mg2+浓度Taq DNA聚合酶用量模板DNA用量引物浓度d NTPs浓度。用6份马铃薯样品DNA对优化体系进行验证,扩增结果清晰稳定,可用于马铃薯遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究。     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

齿裂菌属和皮下盘菌属ISSR-PCR最佳反应条件的研究

在利用ISSR技术分析齿裂菌属和皮下盘菌属遗传多样性的研究中,为获得条带清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的条件进行了筛选,确定了此类菌物ISSR-PCR反应的最适宜条件:在15μLPCR反应体系中,10倍Taq酶缓冲液1.5μL,DNA模板8ng/μL,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.00U,ddH2O9.0μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。     

利用正交设计优化异色瓢虫SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验,试验结果用DPS和MINITAB软件进行分析,建立了异色瓢虫SRAP-PCR反应的最佳体系,即在20μL体系中模板50~100ng、引物0.25μmol/L、dNTPs0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U、Mg2+0.375~0.625mmol/L。并对反应体系进行梯度退火试验,得到最佳退火温度为50.3℃。这一优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行瓢虫遗传图谱的构建、多态性分析和基因定位奠定了技术基础。     

蚬壳花椒ISSR-PCR反应体系的建立及优化

通过单因素试验及正交设计方法对影响蚬壳花椒ISSR-PCR扩增的主要因素(模板DNA、Mg2+的浓度、引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化,以建立蚬壳花椒ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:最佳反应体系(20μL)为模板DNA 60ng、MgCl2 2.5mmol/L、dNTPs 0.15mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶2.4U。在此基础上,从100条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性好的ISSR引物并经过10份蚬壳花椒种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点。该反应体系的建立为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。     

苏铁属植物RAPD反应体系的优化及部分种类亲缘关系的探索

通过优化苏铁属植物的RAPD反应体系,进而探讨苏铁属部分种类的亲缘关系。结果表明,Mg~(2+)、dNTP、Taq酶及随机引物浓度在RAPD反应中有重要影响,而模板DNA浓度有一个很大的适应范围。适合苏铁属植物RAPD分析的反应体系:20μL反应体系中,含有10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、50 mmol/L KCl、2.0mmol/L MgCl_2、200μmol/L dNTP、0.3μmol/L随机引物、模板DNA 50ng、Taq酶1.0 U。聚类分析结果基本反应了苏铁属各个种间的亲缘关系,证明了RAPD适用于苏铁属种间亲缘关系分析。RAPD聚类分析结合形态学研究表明:海南苏铁、台湾苏铁、广东苏铁、滇南苏铁和仙湖苏铁之间的亲缘关系较远,支持各自成为独立的种。     

海南龙血树RAPD-PCR反应体系的优化

采用单因子试验和正交试验设计,对影响海南龙血树RAPD-PCR反应的模板DNA量、Mg2+、dNTP和引物浓度,Taq聚合酶用量等因子进行研究,分析各因子对RAPD-PCR扩增结果的影响,确立了海南龙血树RAPD-PCR反应的最佳条件,即在25 μL反应体系中,包含10×buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L...     

益智有效抗氧化成分的分离条件的研究

探讨了干柱层析法分离益智渣及益智乙醇提取物的抗氧化成分。实验中采用乙酸乙酯/环己烷(3∶7)、氯仿/甲醇(9∶1)为展开剂依次二次干柱层析分离出抗氧化物质。结果表明,益智渣及益智乙醇提取物均有较强的抗氧化性,益智渣的H2O2清除能力强于益智乙醇提取物。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。