Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

 RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默,能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体,与单靶点表达载体比较,探讨其对结肠癌细胞增殖的抑 制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明,分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径,以质粒作为表达载体,同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体,双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.     

RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。     

转cry1Ab基因水稻对二化螟幼虫血细胞的影响

研究了转cry1Ab基因水稻“克螟稻1号”对二化螟Chilo suppressalis幼虫细胞免疫系统的影响。结果表明,转cry1Ab基因水稻对二化螟幼虫的血细胞影响明显,取食转cry1Ab基因水稻后,二化螟幼虫各类血细胞都明显低于取食非转基因水稻“秀水11”的对照组（原血细胞和囊血细胞在取食初期例外）,随取食时间延长,各类血细胞数量及血细胞总数均呈递减的趋势。从各类血细胞所占血细胞总数的百分比来看,原血细胞在取食36 h后锐减,而浆血细胞和粒血细胞则比例增加,其余珠血细胞、囊血细胞的变化不明显。另外,血细胞还出现空泡化、肿胀等病态变化,致使血细胞快速破裂。由此推测转cry1Ab基因水稻自身表达的毒蛋白能严重干扰靶标昆虫二化螟幼虫的细胞免疫系统。     

水稻minE基因的克隆及分析

 植物叶绿体与原核生物分裂机制相似,其中MinE蛋白在细菌分裂过程中具有重要作用. 为了研究植物MinE蛋白在叶绿体分裂过程中的功能及其进化,利用RT PCR技术克隆了水稻叶绿体分裂相关基因OsMinE,并在GenBank登录（No. AY496951）.OsMinE基因cDNA全长1 035 bp,其ORF为711 bp,编码236个氨基酸.与原核生物MinE蛋白相比,水稻OsMinE具有明显延伸的N端与C端.其N端102个氨基酸残基为预测的叶绿体导肽序列,C端延伸保守,推测赋予植物MinE蛋白新的功能.植物minE基因结构分析显示,水稻、拟南芥、杨树都仅含有1个内含子,且插入位置及相位相同.这表明,该内含子可能在单子叶、双子叶植物分化前产生.水稻OsMinE基因在大肠杆菌细胞中的表达严重影响了细胞的分裂,初步证明了水稻MinE蛋白与原核细胞MinE蛋白功能类似.水稻OsMinE基因的克隆为进一步研究叶绿体的分裂机制奠定了基础.     

转Bt基因及其亲本水稻上褐飞虱对三唑磷和溴氰菊酯的反应

以转Bt基因抗虫水稻T1C-19(含cry1C基因)和T2A-1(含cry2A基因)及其亲本水稻MH63为材料,用20和40 mg·L^-1的三唑磷以及1、3和6 mg·L^-1的溴氰菊酯喷雾分别处理稻株上的3龄褐飞虱若虫,研究了两种农药对转Bt基因抗虫水稻上褐飞虱再猖獗的影响.结果表明： 三唑磷处理对褐飞虱的若虫历期无显著性影响,溴氰菊酯则能显著降低若虫历期,但随着两种药剂处理浓度的升高,若虫的存活率降低、成虫的产卵量增加.在同一浓度农药药剂处理下,3个水稻品种上的褐飞虱若虫发育历期、若虫存活率、初羽雌成虫体质量、产卵量和卵孵化率等生态学参数均没有显著差异.表明褐飞虱在两种转Bt水稻上对三唑磷和溴氰菊酯诱导再猖獗的反应能力与其亲本水稻MH63没有差异.     

假单胞菌M18株pltZ基因转录阻抑藤黄绿菌素ABC转运系统

假单胞菌（Pseudomonas sp.）M18株的藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt )生物合成基因簇下游存在一个Plt生物合成负调控基因pltZ和一个负责Plt分泌及自身抗性的ABC（ATP_binding cassette）转运系统基因簇。利用启动子探针载体pME6015和pME6522分别构建ABC转运基因pltH与lacZ的翻译和转录融合表达质粒pHZLF和pHZCF,分别引入野生型假单胞菌M18株和pltZ突变菌株M18Z。半乳糖苷酶活性的测定结果表明：在pltZ突变株M18Z中,pltH’-‘lacZ翻译融合表达水平约比野生型提高3.7～8.4倍,pltH’‘lacZ转录融合表达水平显著提高了2.8～7.4倍,表明pltZ 能在转录水平上阻抑Plt ABC转运系统的表达,pltZ很可能通过阻抑Plt ABC转运系统的表达,间接地负调控Plt的生物合成。     

OsBTF3过表达转基因水稻株系的创制及其分子鉴定

本研究旨在创制OsBTF3过表达转基因水稻株系,为验证OsBTF3基因在水稻抗性和生长发育中的功能、评价其在水稻农艺性状遗传改良中的应用价值提供试验材料。通过基因过表达载体构建、水稻愈伤组织诱导、农杆菌介导愈伤组织转化、植株再生、潮霉素抗性(Hyg^R)筛选及PCR验证、基因过表达RT-Q-PCR检测等方法,成功地获得了97个T₀代和20个T₁代过表达转基因株系,并分别得到分子验证。与野生型对照株相比,5个T₁代过表达株系中的OsBTF3基因表达水平显著提高,平均高达3.58倍。因此,由组成型表达的35S启动子驱动的OsBTF3基因在转基因水稻株系中成功地得到了增量表达,并对水稻生长发育、抗病性和抗逆性具有调控作用。     

水稻二化螟内共生菌杀雄菌属和沃尔巴克氏体的检测与分析

应用杀雄菌属(Arsenophonus)23S rDNA基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia) wsp基因的特异引物,通过PCR扩增的方法对我国20个水稻二化螟地理种群感染两类内共生菌的情况进行了检测.结果表明: 我国水稻二化螟不同地理种群的Arsenophonus和Wolbachia感染率不一致,哈尔滨、惠水、吉林、南阳和扬州5个地理种群的Arsenophonus感染率为5.0%～50.0%;汉中、南宁和扬州3个地理种群的Wolbachia感染率为25.0%～40.0%,其他地理种群中没有检测到这两种共生菌的存在.水稻二化螟不同地理种群感染的Arsenophonus 23S rDNA基因序列完全一致,将该基因株型命名为csArs.但所检测到的Wolbachia wsp基因序列不一致,分别为wChisup1、wChisup5和wChisup6,其中wChisup1属于A群,其他属于B群.这说明水稻二化螟感染的Arsenophonus为同一株型,而感染的Wolbachia株型较为复杂.通过构建系统发育树发现,水稻二化螟体内的Arsenophonus23S rDNA基因和Wolbachia wsp基因与其他物种体内相关序列完全一致或高度相似.     

牦牛与其他物种ZFX/ZFY基因片段间的进化关系

利用PCR扩增、克隆和序列分析法对牦牛ZFX/ZFY基因第11外显子部分片段进行了研究,并同来自于NCBI GenBank中人、猩猩、普通牛等9个物种的ZFX/ZFY基因核苷酸及其氨基酸序列进行了进化分析.结果表明,牦牛ZFX、ZFY基因间核苷酸序列同源性为94.1%,显示同一物种同源基因ZFX/ZFY间存在变异;比较的10个物种间ZFX基因核苷酸序列同源性为87.7%、ZFY基因为81.7%,相应ZFX、ZFY氨基酸同源性分别为96.6%、91.0%,ZFY基因的变异性大于ZFX基因,显示X染色体与Y染色体可能是独立进化.     

转cry1Ac/cpti基因水稻对土壤氨氧化细菌群落组成和丰度的影响

【背景】氨氧化细菌是驱动硝化作用的关键微生物,其群落多样性变化对土壤氮素转化具有重要意义。转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤微生物群落产生影响。【方法】本研究通过田间定位试验,利用特异引物进行PCR DGGE (聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳)和荧光定量PCR,分析了种植转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻第3、4年土壤中氨氧化细菌群落组成和丰度的变化。【结果】水稻各生育期（分蘖期、齐穗期和成熟期）内,转cry1Ac/cpti基因杂交稻Ⅱ优科丰8号（GM）的土壤氨氧化细菌16S rRNA基因群落组成、多样性指数与其对应的非转基因杂交稻Ⅱ优明恢86（CK）间均没有显著差异;以DGGE条带为基础的氨氧化细菌群落组成的冗余分析（RDA)显示,GM和CK的土壤氨氧化细菌群落组成只与水稻生育期存在显著相关性（P=0.〖KG-*8〗002和0.〖KG-*8〗018）;同时,水稻各生育期内土壤氨氧化细菌16S rRNA基因丰度在GM和CK间也没有显著差异,但均随水稻生长而变化且在齐穗期达到最高（P<0.〖KG-*8〗05）。【结论与意义】稻田土壤氨氧化细菌的群落组成与丰度在水稻不同生育期存在差异,但在转cry1Ac/cpti基因水稻和非转基因水稻间没有显著差异,即一定时期内种植转cry1Ac/cpti抗虫基因水稻不会影响土壤氨氧化细菌的群落组成和丰度。     

转cry1Ac/cpti基因水稻对土壤酶活性和养分有效性的影响

【背景】转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤酶活性和养分转化产生影响,转基因作物对土壤质量的影响是其环境安全性评价的重要方面。【方法】本研究通过田间定位试验分析了连续3 a种植2种转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻后,土壤酶活性和养分有效性等土壤质量性状的变化。【结果】在水稻各生育期内,除齐穗期转基因稻科丰8号（GM1）田的土壤酸性磷酸酶活性显著（P<0.〖KG-*8〗05）高于其受体非转基因稻明恢86（CK1）外,转基因稻GM1、GM2（Ⅱ优科丰8号）的土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活性与对应非转基因稻CK1、CK2（Ⅱ优明恢86）间均无显著差异。同时,在水稻生长过程中,土壤pH、有机质、有效氮、有效磷和速效钾等土壤理化指标在GM1和CK1或GM2和CK2间也均无显著差异。【结论与意义】连续3 a种植转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻并未改变稻田土壤中主要营养元素的有效性及其相关土壤酶活性,即短期内种植转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻不会影响土壤酶活性和养分状况。该结果为进一步评价转基因水稻的生态风险提供了一定的依据。     

RNAi和取食不同品种水稻后白背飞虱多铜氧化酶4基因的表达差异及生物学效应

【目的】分析RNAi及取食不同品种水稻后白背飞虱Sogatella furcifera多铜氧化酶4(multicopper oxidase 4, MCO4)基因的表达差异和生物学效应,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】通过生物信息学技术方法分析白背飞虱MCO4基因的核苷酸和氨基酸序列;利用RNAi技术沉默白背飞虱3龄若虫的MCO4基因,检测显微注射法和饲喂法的沉默效率,研究该基因被干扰后对白背飞虱3龄若虫存活率的影响;白背飞虱成虫取食不同抗性水稻品种24 h后,采用RT-qPCR检测其体内MCO4基因表达量的变化,并统计其体重。【结果】白背飞虱MCO4基因的核苷酸序列全长为2 166 bp,编码721个氨基酸。显微注射法进行MCO4基因的RNAi可成功沉默白背飞虱的MCO4基因,且沉默效率远高于饲喂法。MCO4基因被RNAi沉默后白背飞虱3龄若虫存活率显著低于正常若虫的。与取食水稻感虫品种TN1相比,取食水稻抗虫品种IR26的成虫MCO4基因表达量显著增加,且成虫体重显著降低。【结论】显微注射法可以更好地干扰白背飞虱MC04基因的表达。沉默MCO4基因对白背飞虱3龄若虫的存活率有显著影响,我们推测MCO4基因在白背飞虱取食水稻中具有重要的作用。     

苜蓿中华根瘤菌042BMnoeAB基因的转录调控

对苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）042BM noeAB基因的表达调控进行研究。结果发现,葫芦巴碱不能使noeAB的表达水平提高,证明它们的转录不受nodD2的调控。当nodD3和syrM同时存在时,noeAB的表达水平没有明显的变化,表明它们也不受nodD3syrM系统的调控。在FY基本培养基上,毛地黄黄酮的诱导使noeAB基因的表达水平提高16倍,而在不添加该诱导物的TY培养基上,noeAB基因的表达水平也能够提高30倍以上,说明noeAB是受nodD1控制的,但除受毛地黄黄酮诱导外,noeAB还可能受到其他因子的调节。     

PC-１基因表达增强C4-2B前列腺癌细胞生存

建立稳定表达外源PC-１基因的人前列腺癌骨转移C4-2B细胞模型,初步探讨PC- １基因表达对前列腺癌发展的影响.通过脂质体介导的方法,将融合PC-１基因的真核表达载体pcDNA3.1PC-１稳定转染C4-2B细胞,Western 印迹和RT-PCR技术,分别从蛋白水平和RNA水平确定外源PC-１基因表达. MTT和软琼脂集落形成能力等一系列方法,研究PC-１基因的功能,RT-PCR和实时定量PCR检测前列腺癌发生发展相关基因表达的变化. 结果表明,PC-１基因的高表达能够诱导雄激素受体（AR）调控基因和一系列重要的信号通路成员基因PSA、PSMA、NKX31、Jagged1、EphA3、SGEF和 NOTCH3等表达发生变化. 实验结果初步证明,PC-１基因表达在晚期前列腺癌中,以及在雄激素非依赖的转变中可以发挥作用,PC-１基因表达可调控一些重要信号通路.对PC-１基因功能深入研究将有可能为发现新的前列腺癌的诊断治疗分子靶标提供线索.     

高温胁迫对Bt棉铃壳中Bt蛋白含量及氮代谢的影响

以Bt基因来源于中国的棉花品种泗抗1 号(常规种)、泗抗3 号(杂交种)和来源于美国的棉花品种99B(常规棉)、岱杂1 号(杂交棉)为材料,研究了不同高温水平下Bt 棉盛铃期铃壳中Bt 蛋白含量变化及氮代谢生理特征.结果表明: 铃壳中Bt 蛋白含量随温度升高而降低,与对照相比(32 ℃),常规棉品种在38 ℃、杂交棉品种在40 ℃以上时,铃壳中Bt 蛋白含量大幅度下降.其中,常规种泗抗1号和99B在38 ℃时分别下降53.0%和69.5%;杂交种泗抗3号和岱杂1号在40 ℃时下降64.8%和54.1%.铃壳Bt 杀虫蛋白含量下降显著时,其可溶性蛋白含量明显下降,游离氨基酸含量明显提高,GPT活性显著下降,蛋白酶活性显著增加.高温影响铃壳的氮代谢引起Bt蛋白的分解加剧,合成减弱,从而造成Bt蛋白含量减少,抗虫性下降.     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

LCB1基因表达对酵母神经酰胺合成的影响

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LCB1（Long chain base）基因被克隆到酵母诱导表达载体pYES2中,并转入到FY2中,用半乳糖诱导表达。与对照相比,质粒所含LCB1基因的表达,使酵母细胞干重略有下降,而神经酰胺的含量提高为对照的1.9倍。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的15kb片段,中间插入编码Kmr的DNA片段,获得rsmA-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R-。突变株M18R-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20%。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

转Bt基因水稻表达的毒蛋白Cry1Ab在害虫及其捕食者体内的积累动态

在室内对转基因水稻KMD1中的Cry1Ab毒蛋白经食物链在几种主要害虫及其捕食性天敌体内的积累进行了研究。结果表明： 无论是水稻孕穗期还是成熟期,二化螟Chilo suppressalis连续取食KMD1或取食KMD1.36 h后移至对照品种秀水11上取食不同时间后,幼虫体内的Cry1Ab含量均随取食时间延长逐渐下降。稻眼蝶 Mycalesis gotama幼虫连续取食KMD1或在KMD1上取食两天后移至秀水11上继续取食不同时间,体内的Cry1Ab含量也都随取食时间延长而下降,但下降速度较二化螟更快。取食KMD1的二化螟和稻眼蝶幼虫的粪便中均检测到较高浓度的Cry1Ab,对照组中均无Cry1Ab。取食KMD1的二化螟幼虫血淋巴中检测到Cry1Ab,含量为3.5 ng/g。取食KMD1的褐飞虱 Nilaparvata lugens、稻蚜Sitobion avenae以及饲喂取食过KMD1的二化螟或稻眼蝶幼虫的拟水狼蛛Pirata subpiraticus体内都含有一定浓度的Cry1Ab,其中,拟水狼蛛体内的CrylAb含量以饲喂取食KMD1稻眼蝶幼虫的含量最高,约为饲喂取食KMD1二化螟幼虫的60倍。这些结果表明Cry1Ab可以沿水稻害虫天敌食物链传递。