聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究出芽短梗霉聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因及其酶学特性。【方法】通过设计兼并引物,采用IPCR技术从出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组中扩增得到苹果酰辅酶A连接酶基因的cDNA全长序列,构建表达载体,通过大肠杆菌异源表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】获得苹果酰辅酶A连接酶基因序列全长为1498 bp,编码440 aa,含有4个外显子和3个内含子。该重组酶最适反应温度为25℃,最适反应pH值为8.0,高浓度底物ATP明显对酶活性具有抑制作用,单体选择性表明对底物草酸、草酰乙酸、丁酸、丙二酸也具有很好催化活性。【结论】成功从出芽短梗霉CCTCC M2012223中克隆获得聚苹果酸聚合途径的苹果酰辅酶A连接酶基因,为聚苹果酸聚合途径解析及新型可降解材料创制奠定基础。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

出芽短梗霉菌株PA-2全基因组测序及分析

【背景】出芽短梗霉菌株PA-2是一株分离自青海省海东市平安区患病杨树叶片上的真菌,前期研究表明该菌株具有除草和抑菌能力,说明其在生物农药方面具有潜在的应用前景。【目的】了解菌株PA-2的基因组序列信息,挖掘其生防相关功能基因簇,为进一步研究解析该菌株生防机理及生防功能改造提供遗传背景信息。【方法】利用IlluminaHiSeq高通量测序平台对生防菌株PA-2进行全基因组测序,用生物信息学的方法对测序数据进行基因组组装、基因预测及功能注释、碳水化合物活性酶预测、次级代谢产物合成基因簇预测,利用刚果红染色等方法对水解酶活性进行衡量。【结果】菌株PA-2基因组序列全长28 932 793 bp,平均GC含量为50%,共编码10 839个基因,预测到该菌株具有4个已知的次级代谢产物合成基因簇,编码Melanin、Burnettramic Acid A、ACR-Toxin I、Abscisic Acid,该菌株能水解纤维素和果胶。【结论】有助于在基因组层面上解析菌株PA-2生防机制的内在原因,为深入了解出芽短梗霉菌次级代谢物合成途径提供参考,对菌株PA-2的下一步相关研究具有重要意义。     

基于全基因组数据华根霉产真菌毒素分析

【目的】在对中国传统优势浓香型白酒产业中重要功能微生物华根霉菌株CCTCCM201021全基因组测序的基础上,以生物信息学的方法和手段主要针对真菌毒素的合成代谢途径及关键基因进行分析,考察微生物在食品工业应用中的安全性。【方法】应用Illumina平台Solexa测序技术对华根霉进行基因组测序,运用SOAPdenovo组装软件进行拼接,并进行一系列生物信息分析,考察根霉素、小孢根霉素及典型丝状真菌毒素代谢的主要途径及相关基因,包括PKS、NRPS与PKS-NRPS混合代谢途径;萜类化合物代谢和其他代谢途径等,判断华根霉是否具有产真菌毒素的潜在危害性。【结果】测序结果表明华根霉全基因组大小为45.70 Mb左右,GC含量为36.99%。通过基因预测软件分析得到基因17 676个,共注释基因13 243个。通过进化树与同源基因比较分析,与目前基因组测序完成的仅有的3株接合菌基因组相比,序列相似性普遍偏低,与华根霉存在较为显著的差异,但同源基因的相似性在60%左右。代谢分析表明,华根霉中仅存在较少聚酮合成、萜类化合物合成途径代谢基因,存在大量异源物质降解途径基因。【结论】华根霉基本不具备产目前已知的真菌毒素的关键基因或合成能力,可以认为其发酵产品是相对安全的。在酿造过程中,不仅可作为糖化菌,在混菌发酵时,对部分具有抑菌能力的抗生物质具有降解功能,是发酵工业中应用的相对安全的重要生产菌。     

一株出芽短梗霉全基因组序列测定及其分析

出芽短梗霉因其发酵产物种类的多样性而具有广阔的工业应用前景。本研究利用下一代测序技术,对一株高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012259)全基因组进行测序、组装和生物信息学分析。研究表明,该菌株的基因组全长约为26.37 Mb,共包含36条scaffolds和76 contigs,Gen Bank登录号:PRJNA350822。利用Gene Mark-ES软件对该基因组进行基因预测,共得到10 069个编码蛋白的基因。使用Blastp将其与Uniprot KB数据库中所有已知真菌蛋白进行比对,发现有6 218个预测蛋白与Uniprot KB数据库中的4 925个已知蛋白高度相似。利用DAVID工具对这些蛋白进行GO基因功能注释、KEGG通路注释和蛋白酶分析,分别注释得到4 444条GO功能条目、1 566条KEGG通路条目和1 740条蛋白酶信息。测定与分析为今后针对出芽短梗霉的功能基因挖掘以及分子遗传改造等工作的开展奠定了坚实的理论基础。     

基因组分析揭示拟茎点霉XP-8产松脂醇及其糖苷等多种次级代谢产物的合成途径

【目的】通过解析拟茎点霉属XP-8的基因组序列信息,揭示该菌株潜在的代谢途径,并分析松脂醇及其糖苷化合物等次级代谢产物生物合成相关的关键基因。【方法】使用Illumina Hi Seq 2500高通量测序平台对拟茎点霉XP-8菌株进行全基因组测序,并通过不同软件对测序数据进行序列拼接,基因预测与功能注释。【结果】组装后的拟茎点霉XP-8基因组大小为55.2 Mb,GC含量53.5%,含有17094个蛋白编码基因和310个非编码基因。获得了松脂醇及其糖苷化合物等次级代谢产物生物合成相关的基因。系统发育分析揭示出拟茎点霉XP-8与5种子囊菌共有12635个同源基因和5626个基因家族。【结论】拟茎点霉XP-8具有用于合成松脂醇及其糖苷化合物等多种次级代谢物的基因组基础,为下一步的代谢工程改造提供依据。     

一株重寄生枝孢菌的基因组测序及重寄生机制分析

【背景】枝孢菌SYC63是一株具有重寄生作用和抗菌活性的潜在生防菌株,目前尚无研究报道该菌株的全基因组序列,因此限制了其开发与利用。对该菌株进行基因组测序与分析,将进一步了解其重寄生的分子机制,为其在生物防治上的应用奠定研究基础。【目的】解析枝孢菌SYC63基因组序列信息,初步探究该菌的重寄生作用机制。【方法】利用二代高通量测序平台对枝孢菌SYC63进行全基因组测序,运用相关软件对其测序数据进行基因组组装、基因功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇并分析重寄生相关的碳水化合物酶类基因等。【结果】基因组组装后共得到17个contigs,总长度为31 912 211 bp,GC含量为52.80%,预测到12 327个编码基因。其中,4 029、949和6 595个基因分别能在KEGG、COG和GO数据库中被注释到,同时还预测到25个次级代谢产物合成基因簇。对重寄生机制相关的碳水化合物酶类进行分析并与重寄生菌株(拟盘多毛孢菌、木霉及盾壳霉)比较,发现该菌具有较多的糖苷水解酶和糖脂酶基因,而且细胞壁降解酶类基因经锈菌孢子壁处理后在转录组测序中显著上调表达,初步分析了该菌与重寄生木霉在分子水平上的...     

微泡菌属菌株YPW1和YPW16多糖降解特性分析

【背景】海洋环境中分离到的微泡菌属菌株具有多糖降解能力,在环境中可以作为糖类代谢的重要执行者参与海洋碳循环过程。【目的】测定2株微泡菌属菌株的多糖降解活性,通过与微泡菌属其他菌株基因组比较分析2株菌的多糖降解基因特征。【方法】通过3,5-dinitrosalicylicacid(DNS)定糖法测定多糖降解活性,同时利用高通量测序技术对菌株基因组序列进行测定与组装,并与其他基因组注释结果进行比较分析。【结果】分离得到2株微泡菌属菌株YPW1和YPW16,二者均为潜在新种。结果表明,菌株YPW1能够降解琼胶、褐藻胶、果胶、几丁质、木聚糖、淀粉、普鲁兰等7种多糖,而菌株YPW16仅可降解淀粉和普鲁兰。基因组分析表明,YPW1具有上述7种多糖的降解酶基因,但菌株YPW16只具有淀粉酶与普鲁兰酶降解基因。相较于其他微泡菌属菌株,菌株YPW1多糖降解范围、多糖降解酶基因种类与丰度较高,但菌株YPW16多糖降解范围却较为狭窄。由此可知,多糖降解酶基因在微泡菌属基因组中的分布差异性较大。【结论】本研究为微泡菌属提供了2株潜在的新型菌株资源,为生物多糖降解提供了生化工具,也为研究微泡菌属菌株中多糖降解基...     

桑氏链霉菌KJ40全基因组测序及分析

【背景】桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)KJ40是一株具有防病、促生多重功能的放线菌,有作为生物农药的潜力。目前还没有相关研究报道S.sampsonii全基因组序列,这限制了其功能基因、代谢产物合成途径及比较基因组学等研究。【目的】解析S.sampsonii KJ40的基因组序列信息,以深入研究该菌株防病促生机制及挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】利用Illumina HiSeq高通量测序平台对KJ40菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇、共线性分析等。【结果】基因组最后得到9个Scaffolds和578个Contigs,总长度为7 261 502 bp,G+C%含量平均为73.41%,预测到6 605个基因、1 260个串联重复序列、804个小卫星序列、67个微卫星序列、90个tRNA、9个rRNA和19个sRNA。其中,2 429、3 765、2 890、6 063和1 911个基因分别能够在COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot数据库提取到注释信息。同时,还预测得到21个次级代谢产物合成基因簇。基因组测序数据提交至NCBI获得Gen Bank登录号:LORI00000000。S.sampsonii KJ40与Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350三株链霉菌基因组存在翻转、易位等基因组重排,3个基因组共有1 711个蛋白聚类簇。【结论】研究为从基因组层面上解析KJ40菌株具有良好促生防病效果的内在原因提供基础数据,为深入了解链霉菌次级代谢合成途径提供参考信息,对S.sampsonii后续相关研究具有重要意义。     

Discovering the role of the apolipoprotein gene and the genes in the putative pullulan biosynthesis pathway on the synthesis of pullulan,heavy oil and melanin in <Emphasis Type="Italic">Aureobasidium pullulans</Emphasis>

Pullulan produced by Aureobasidium pullulans presents various applications in food manufacturing and pharmaceutical industry. However, the pullulan biosynthesis mechanism remains unclear. This work proposed a pathway suggesting that heavy oil and melanin may correlate with pullulan production. The effects of overexpression or deletion of genes encoding apolipoprotein, UDPG-pyrophosphorylase, glucosyltransferase, and α-phosphoglucose mutase on the production of pullulan, heavy oil, and melanin were examined. Pullulan production increased by 16.93 and 8.52% with the overexpression of UDPG-pyrophosphorylase and apolipoprotein genes, respectively. Nevertheless, the overexpression or deletion of other genes exerted little effect on pullulan biosynthesis. Heavy oil production increased by 146.30, 64.81, and 33.33% with the overexpression of UDPG-pyrophosphorylase, α-phosphoglucose mutase, and apolipoprotein genes, respectively. Furthermore, the syntheses of pullulan, heavy oil, and melanin can compete with one another. This work may provide new guidance to improve the production of pullulan, heavy oil, and melanin through genetic approach.     

一株高产苯乳酸的古墓土壤葡糖醋杆菌FBFS97的全基因组测序与分析

【背景】苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种应用潜力巨大的天然广谱抑菌物质。本课题组前期分离得到一株高产PLA的醋酸菌(acetic acid bacteria,AAB)——葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)FBFS97,但尚未鉴定到种,而且其产PLA的分子机理尚不清楚。【目的】确定FBFS97的种属关系,解析FBFS97的遗传信息,特别是与PLA产生相关的基因。【方法】采用光学显微镜和扫描电镜对FBFS97的菌体形态进行表征,通过16S rRNA基因序列分析对FBFS97进行分类鉴定,并以高效液相色谱分析苯丙氨酸对其产PLA的影响。在此基础上,对FBFS97进行全基因组测序、拼接和基因预测,并进行GO/COG聚类、KEGG代谢通路和VFDB毒力等分析,以及PLA生物合成途径的预测。【结果】根据16S rRNA基因序列的比对结果,结合形态学分析,该菌被鉴定为古墓土壤葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter tumulisoli)。将1 000 mg/L苯丙氨酸添加到FBFS97液体培养基中,发酵液中PLA最高浓度可达400 mg/L,为对照组的8倍。该菌的基因组大小为3 988 308 bp,(G+C)mol%含量为66.62%,编码基因3 500个;KEGG代谢通路分析表明,该菌基因组中存在经莽草酸途径合成PLA的所有基因;VFDB毒力预测结果显示,该菌基因组中不存在产生毒素的相关基因。【结论】首次报道了一株高产PLA的AAB——古墓土壤葡糖醋杆菌FBFS97的全基因组序列信息,并发现该菌株的基因组中含有合成PLA的所有相关基因,为后续进一步研究FBFS97产生PLA的生物合成途径提供了理论依据。     

Sodium chloride improves pullulan production by Aureobasidium pullulans but reduces the molecular weight of pullulan

Applied Microbiology and Biotechnology - The effect of sodium chloride (NaCl) on pullulan production by batch culture of Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012259 was investigated. NaCl at...     

出芽短梗霉产聚苹果酸发酵条件的优化

【背景】出芽短梗霉可发酵葡萄糖生成聚苹果酸,但存在转化率和转化效率低等瓶颈,阻碍其实现商业化生产。【目的】通过优化发酵培养条件,提高出芽短梗霉的聚苹果酸产量、糖酸转化率和生产强度。【方法】采用单因素试验优化适宜出芽短梗霉BK-10菌株产生聚苹果酸的培养条件,通过Plackett-Burman法对培养基组分筛选显著性影响因素,并对其培养基中无机盐进行正交试验优化,最后进行5 L发酵罐验证。【结果】最优培养基配方和培养条件:100 g/L葡萄糖,1.5 g/L尿素,0.20 g/L KH_2PO_4,0.20 g/L ZnSO_4,0.05 g/L MgSO_4,0.75 g/L KCl,30 g/L CaCO_3,0.01%吐温-80,发酵温度26°C,250 mL摇瓶装液量50 mL。【结论】通过优化,聚苹果酸的糖酸转化率达到0.71 g/g,生产强度达到0.89 g/(L·h),较优化前分别提高了18.33%和71.15%,为发酵葡萄糖合成聚苹果酸进而生产L-苹果酸工艺的工业化生产奠定经济性基础。     

奥利万星中间体A82846B产生菌拟孢囊菌CCTCC M2020063全基因组序列分析与mbtH类基因的验证

[目的] 分析荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063中A82846B合成的代谢途径和关键基因。[方法] 使用Illumina二代测序和PacBio三代测序技术对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063进行全基因组测序,利用Glimmer预测编码序列,使用HPLC和LCMS鉴定次级代谢产物,使用antiSMASH 5.0软件预测次级代谢产物合成基因簇。利用Geneious软件对A82846B合成相关基因进行分析,对其中的mbtH类基因着重分析。[结果] 本实验菌株鉴定为荒漠拟孢囊菌（Kibdelosporangium aridum）,基因组中有一条线性染色体,无质粒,序列全长12475688 bp,GC含量为66.27%,有11900个开放阅读框,共有47个基因簇。该菌株具有合成A82846B的能力,且生物合成相关基因位于Cluster32,包含33个基因,mbtH类基因gene07864的过表达促进A82846的合成,提升了26.42%,卤化酶基因为gene07859,与万古霉素、巴利霉素的卤化酶相似度较高。[结论] 本研究对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063进行了基因组序列分析,获得了A82846B生物合成相关的功能基因信息,为A82846B的代谢途径和工程改造提供了强有力的基础。     

巢湖铜绿微囊藻Chao 1910的基因组学和磷代谢通路分析

【背景】铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)广泛分布于温带湖泊,因产生微囊藻毒素且易成为蓝藻水华优势藻株而备受关注。【目的】基于全基因组序列分析和基因转录水平验证,阐明从巢湖新分离的铜绿微囊藻Chao 1910的主要代谢通路和磷营养高效利用机制。【方法】通过第三代测序技术拼接获得Chao1910的全基因组序列,完成主要代谢通路的基因注释,并对与蓝藻水华优势藻株形成相关的磷代谢通路进行深入分析。【结果】比较基因组学表明,Chao1910藻株与日本铜绿微囊藻NIES-843的亲缘关系最近,其糖酵解、磷酸戊糖途径和核苷酸合成等代谢通路的基因组成非常保守,同时具有完整的磷转运、磷吸收、多聚磷酸盐合成/分解等磷营养高效利用的通路。不同于其他铜绿微囊藻,Chao 1910藻株不具有微囊藻毒素合成基因簇,推测其主要依靠对磷营养的高效利用获取生存竞争优势。【结论】Chao1910藻株是巢湖首株完成全基因组测序的铜绿微囊藻,这将有助于揭示其获得生存竞争优势的分子机制,为遏制巢湖蓝藻水华暴发提供依据。     

Pullulan-hyperproducing color variant strain of Aureobasidium pullulans FB-1 newly isolated from phylloplane of Ficus sp

The studies were carried out for the isolation of efficient pullulan producing strains of Aureobasidium pullulans. Five strains were isolated from phylloplane of different plants. Amongst these, three were producing black pigment melanin, while the remaining two produced pink pigment. These two color variant isolates of A. pullulans were designated as FB-1 and FG-1, and obtained from phylloplane of Ficus benjamina and Ficus glometa, respectively. The parameters employed for the identification of the isolates included morphology, nutritional assimilation patterns and exopolysaccharide (EPS) production. Isolates were compared with standard cultures for EPS production. A. pullulans FB-1 was the best producer of pullulan giving up to 1.9, 1.4 and 1.7 times more pullulan than the control of A. pullulans NCIM 976, NCIM 1048 and NCIM 1049, respectively. The IR spectra of the isolates and standard strains revealed that the polysaccharide was pullulan, but not aubasidan. The study also supported the fact that A. pullulans is a ubiquitous organism and phylloplane being the important niche of the organism.     

宁夏地区一株奶牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行株的高通量测序分析

【背景】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是一种常见的条件性致病菌,由MRSA感染导致的奶牛乳腺炎给奶牛养殖户带来了重大的经济损失。【目的】了解宁夏地区奶牛源MRSA流行株基因组序列特征,为MRSA感染的防治提供理论依据。【方法】采用琼脂扩散法对分离株ld11进行抗菌药物敏感性试验,同时运用Illumina高通量测序平台对其基因组DNA进行高通量测序,使用网络数据库对获得的测序序列进行处理分析。【结果】药敏试验结果显示分离株ld11对头孢噻呋、磺胺异恶唑、氨苄西林、红霉素、庆大霉素、苯唑西林、克林霉素、四环素和多西环素耐药,数据分析显示分离株ld11携带耐药基因aadD、spc、str、blaZ、mecA、cat(pC194)、erm(A)、norA、tet(k)和tet(M),二者之间有很好的相关性;分离株ld11携带的耐药基因多于MRSA参考菌株,且分离株ld11和MRSA252的亲缘关系较近。COG功能分析和GO注释结果显示,与维持菌体基本功能和菌株生长增殖相关的基因占优势;KEGG通路分析结果显示,属于代谢通路的基因占比最多。从该菌株基因组序列上共检测到4个基因岛、9个疑似的CRISPR序列和1个完整的前噬菌体序列。【结论】揭示了宁夏地区奶牛源MRSA流行株的部分基因组序列信息,为MRSA菌株间基因组序列信息的比较分析及MRSA感染的防控提供参考依据。     

藤黄微球菌V017基因组测序及对辐照的转录组响应

【背景】耐辐射微生物是一类重要的极端微生物资源,在研究其耐受机制以及环境保护等方面具有重大的意义。【目的】从基因组和转录组角度解析耐辐射藤黄微球菌(Micrococcus luteus)V017的抗性遗传背景以及对辐照的转录组响应。【方法】利用PacBio平台对菌株V017进行基因组测序,通过比较基因组分析菌株V017特有的基因序列,并通过RNA测序分析菌株V017对伽马辐照的转录组响应及其差异表达基因。【结果】通过从头组装获得菌株V017的完全基因组,其大小为2 527 399 bp,GC含量为72.9%;比较基因组分析发现菌株V017基因组中存在特有的移动元件序列,可能有助于适应辐照极端环境。转录组分析表明菌株V017在辐照处理后,脂肪酸和色氨酸等基础代谢途径显著下调,而与DNA损伤修复相关的代谢途径则显著上调,其中同源重组修复可能是菌株V017响应辐照的主要途径。【结论】根据藤黄微球菌V017的基因组和转录组分析表明,细胞可能利用特异性的移动元件序列通过DNA重排适应辐照环境,同时通过启动DNA损伤修复和改变一些基础代谢响应辐照胁迫,这可能是菌株V017产生中度辐照抗性特性的重要原因。这些研究为进一步理解耐辐射微生物的适应和抗性机制,以及耐辐射微生物资源的开发利用奠定基础。