糖尿病性膀胱病逼尿肌中SCFmRNA和SCF蛋白的表达

目的：检测DCP逼尿肌中SCF表达水平,探讨SCF基因表达与DCP关系及其发病机制。方法：按1：2病例对照研究,采用链脲佐菌素（STZ）及尿动力学检测成功建立DCP豚鼠20只为实验组,并以同质豚鼠40为对照组,应用RT-PCR和Western-blotting方法分别检测各组膀胱逼尿肌中SCF mRNA、SCF蛋白的表达。结果：DCP豚鼠组织中SCF mRNA表达与正常对照组比较无明显显著差异（P〉0.05）,DCP豚鼠组织中SCF蛋白表达明显低于正常对照组（P〈0.01）。结论：DCP组织中SCF蛋白表达减少与SCF基因翻译水平异常有关,因此高血糖环境下SCF基因表达异常可能是DCP的发病机制之一。     

支气管哮喘豚鼠肺组织中KLF2 的表达及意义

目的:探讨锌指Krüppel样转录因2(KLF2)在豚鼠支气管哮喘肺组织中的表达及意义。方法:30只健康雄性豚鼠,按随机数字表法分为对照组(A组)、哮喘组(B组)及地塞米松治疗组(C组),每组10只。卵清蛋白致敏法复制哮喘模型。观察豚鼠肺组织病理学改变,BALF细胞总数及分类计数;采用原位杂交和RT-PCR检测肺组织中KLF2的mRNA表达情况,免疫组化和Westernblot检测肺组织中KLF2的蛋白表达水平。结果:(1)哮喘组豚鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、中性粒细胞百分比(NEU%)显著高于对照组(P<0.01),哮喘组肺组织可见大量炎症细胞浸润,及明显气道重塑改变,而地塞米松治疗组BALF炎细胞浸润及肺组织病理改变较哮喘组明显减轻;(2)KLF2mRNA和蛋白在哮喘组表达显著低于对照组,在地塞米松治疗组中的表达明显高于哮喘组,3组差异均有统计学意义(P均<0.01);(3)KLF2蛋白以及mRNA与肺泡灌洗液炎细胞总数及EOS%,NEU%呈负相关。结论:KLF2在支气管哮喘急性发作期模型中表达明显下降,而地塞米松治疗后KLF2的表达上调,提示KLF2可能在支气管哮喘的发病机制与防治中起重要作用。     

糖代谢异常对大鼠肝脏组织中巨噬细胞移动抑制因子及C-Jun氨基端激酶表达水平的影响

目的观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和C-Jun氨基端激酶(JNK)在糖代谢异常大鼠肝脏组织中表达水平的变化,探讨糖代谢异常合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)的病理机制。方法将60只大鼠随机分为糖耐量受损(IGT)模型组(n=20)、2型糖尿病(T2DM)模型组(n=20)、IGT对照组(n=10)及T2DM对照组(n=10),高脂饲料喂养复制IGT大鼠模型,高脂饲料喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)制备T2DM大鼠模型,采用TUNEL法检测各组大鼠肝脏细胞凋亡;实时荧光PCR技术检测肝脏组织中MIF mRNA的表达;Western blot方法检测肝脏组织中MIF、caspase-3、JNK蛋白表达及磷酸化JNK(p-JNK)的表达。结果 IGT大鼠及T2DM大鼠肝组织凋亡细胞明显增多;IGT组和T2DM组肝组织MIF基因表达较各自对照组明升高(P0.01),MIF、caspase-3、JNK蛋白表达及JNK磷酸化水平也明显升高(P0.05或P0.01);与IGT组相比,T2DM组caspase-3、MIF、JNK蛋白表达水平明显降低(P0.01),而JNK磷酸化水平是明显升高(P0.01)。结论糖代谢异常合并非酒精性脂肪肝的发生可能与MIF、caspase-3、JNK表达水平的升高及JNK磷酸化水平的增强有关。     

支气管哮喘豚鼠肺组织中KLF2的表达及意义

目的：探讨锌指Krüppel样转录因2（KLF2）在豚鼠支气管哮喘肺组织中的表达及意义。方法：30只健康雄性豚鼠,按随机数字表法分为对照组（A组）、哮喘组（B组）及地塞米松治疗组（C组）,每组10只。卵清蛋白致敏法复制哮喘模型。观察豚鼠肺组织病理学改变,BALF细胞总数及分类计数;采用原位杂交和RT-PCR检测肺组织中KLF2的mRNA表达情况,免疫组化和Westernblot检测肺组织中KLF2的蛋白表达水平。结果：（1）哮喘组豚鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比（EOS%）、中性粒细胞百分比（NEU%）显著高于对照组（P〈0.01）,哮喘组肺组织可见大量炎症细胞浸润,及明显气道重塑改变,而地塞米松治疗组BALF炎细胞浸润及肺组织病理改变较哮喘组明显减轻;（2）KLF2mRNA和蛋白在哮喘组表达显著低于对照组,在地塞米松治疗组中的表达明显高于哮喘组,3组差异均有统计学意义（P均〈0.01）;（3）KLF2蛋白以及mRNA与肺泡灌洗液炎细胞总数及EOS%,NEU%呈负相关。结论：KLF2在支气管哮喘急性发作期模型中表达明显下降,而地塞米松治疗后KLF2的表达上调,提示KLF2可能在支气管哮喘的发病机制与防治中起重要作用。     

葡萄糖调节蛋白78在子痫前期中的表达及其意义

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)mRNA及蛋白在胎盘组织的表达水平及其与子痫前期的发病关系。方法:选择2010年1月-2010年12月在南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院产科住院的子痫前期患者35例(子痫前期组),以同期正常孕妇35例为对照组。采用RT-PCR技术、蛋白印迹(western-blot)法和免疫组化检测两组孕妇胎盘组织中GRP78的mRNA与蛋白表达水平差异。结果:子痫前期组患者胎盘组织中GRP78mRNA与蛋白表达水平均显著高于相应孕周正常妊娠组。结论:子痫前期能够诱导GRP78表达,CHOP/GADD153表达的增高与子痫前期的发病有关。     

豚鼠动脉粥样硬化模型形成机制:LDL-C代谢异常

目的建立豚鼠动脉粥样硬化模型并探讨其形成机制,同时与大鼠进行比较,阐明模型特点及优势。方法应用高脂饲料诱导方法,观察豚鼠和大鼠动脉粥样硬化病变的形成情况。HE染色法分析主动脉内膜-中膜厚度、内膜炎性细胞浸润和内膜表层斑块的形成情况;酶法检测血脂,酶联免疫吸附法测定血清Ox-LDL浓度,实时定量PCR检测肝脏LDL-R mRNA表达的变化,免疫组化检测血管内膜CD36蛋白表达的变化。结果与对照组比较,豚鼠模型组动脉内膜明显增厚,单核细胞、巨噬细胞浸润与聚集增加,大量的泡沫细胞聚集形成斑块,而大鼠模型组未出现类似动脉粥样硬化病理改变。机制研究表明豚鼠较大鼠易于诱发形成动脉粥样硬化原因主要在于豚鼠血清Ox-LDL水平明显升高,肝脏LDL-R mRNA表达下调,动脉内膜CD36蛋白表达明显增强等。结论与大鼠不同,经高脂饲料诱导10周后,豚鼠可形成典型动脉粥样硬化病变,其机制主要在于LDL-C代谢异常。     

拟南芥ASK基因研究进展

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是广泛存在于真核生物中的一种重要的蛋白降解系统。拟南芥ASK(Arabidopsis SKP1-LIKE)基因编码拟南芥E3连接酶SCF复合物的一个亚蛋白,在拟南芥SCF复合物中起到连接器的作用。近年来,人们对ASK基因及其同源基因进行了很多表达规律、基因功能方面的研究。本文从ASK基因表达方式、对生理发育过程的调节、与F-box相互作用及ASK基因的进化方式4个方面对这些进展进行总结。已有的研究结果表明,ASK基因在拟南芥中广泛地表达并表现出各自不同的表达水平和表达方式,它们在很多发育和生理过程中起到重要作用。     

基于AMPK/SREBP-1通路研究狗肝菜多糖对高脂饮食大鼠糖脂代谢的影响

本研究探讨狗肝菜多糖(DCP)对高脂饮食大鼠糖脂代谢的作用及机制。实验采用高脂饲料喂养8周,将造模成功的40只大鼠随机均分为正常组、模型组、DCP剂量组(100、200 mg/kg),每组10只;从第9周开始,DCP剂量组灌胃给药,正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃,持续6周,处死,收集血样和肝脏。采用生化法检测血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、游离脂肪酸(FFA)、糖基化终产物-肽(AGE-P)和糖化血红蛋白(HbA1c)含量,及肝脏中TG和肝糖原含量;葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG),酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清空腹胰岛素(FINS)含量,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);油红O染色观察肝组织脂肪沉积状况;蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测大鼠肝组织中胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表达情况;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测SREBP-1 mRNA、AMPK mRNA水平。结果显示,DCP(100和200 mg/kg)剂量组能显著下调TC、TG、LDL-C、FBG、FINS、AGE-P和HbA1c含量和HOMA-IR,上调HDL-C和肝糖原含量,减少脂肪沉积物,同时明显上调p-AMPK水平,抑制肝组织SREBP-1蛋白及其mRNA的表达。结果表明,DCP调节大鼠糖脂代谢的机制可能与调控AMPK/SREBP-1通路有关。     

PPARγ/PGC-1α在支气管哮喘豚鼠肺组织中表达及作用

目的:观察PPARγ和PGC-1α在豚鼠支气管哮喘肺组织中表达而探索PPARγ/PGC-1α对哮喘作用机制.方法:加只健康雄性豚鼠随机化原则分成对照组(A组)、哮喘组(B组)、地塞米松(C组)和罗格列酮治疗组(D组)每组10只豚鼠.卵蛋白致敏法复制哮喘模型,第16天始每日诱喘前30min C组和D组分别给予约3至5ml溶有药物的生理盐水灌胃:C组地塞米松2mg/kg,D组罗格列酮4mg/kg连续14天.测细支气管炎症细胞浸润及支气管重塑指标,肺组织病理;原位杂交和RT-PCR检测PPARγ和PGC-1α的mRNA表达免疫组化和Western blot检测肺组织两者蛋白表达.结果:(1)哮喘组出现了明显气道重塑和炎症细胞浸润,地塞米松和罗格列酮对其起抑制作用.(2)原位杂交和RT-PCR显示PPARγ和PGC-1αmRNA哮喘组表达最低四组差异均有统计学差异(P均<0.01);免疫组化和Western blot显示PPARγ和PGC-1α蛋白哮喘组表达几乎都呈阴性而且以核内表达为主,四组差异均有统计学意义(P均<0.01);地塞米松和罗格列酮可上调PPARα和PGC-1γ蛋白以及mRNA的表达.(3)支气管哮喘豚鼠肺组织PPARγ与PGC-1α表达呈正相关,PPARγ和PGC-1α蛋白以及mRNA与浸润的嗜酸粒细胞、Wal%、SMC-A%呈负相关.结论:PPARγ/PGC-1α在卵蛋白致敏急性支气管哮喘模型中表达下降,罗格列酮和地塞米松一样可上调PPARγ/PGC-1α,PPARγ/PGC-1α对哮喘发病起重要作用而可能为哮喘防治开辟新途径.     

沉默细胞分裂相关基因NUF2的表达对卵巢癌细胞侵袭及迁移的影响

目的:研究沉默细胞分裂相关基因NUF2的表达对卵巢癌细胞侵袭及迁移的影响,并初步探讨其潜在的分子作用机制。方法:用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测卵巢癌组织和细胞中NUF2的表达情况;将卵巢癌HEY、SKOV3细胞分为空白对照组、control siRNA(si-control)组和NUF2 siRNA(si-NUF2)组,用qRT-PCR检测各组细胞的NUF2 mRNA表达水平以验证转染效果;Transwell小室实验和细胞划痕实验检测沉默NUF2后各组细胞侵袭、迁移能力的改变;蛋白印迹法检测各组细胞中Notch通路相关蛋白Notch1、Hes1的表达水平。结果:NUF2在卵巢癌组织或细胞中均高表达,差异均有统计学意义(P0.05);与空白对照组和sicontrol组相比,si-NUF2组细胞中NUF2 mRNA表达水平显著下降(P0.05),侵袭、迁移细胞数明显减少(P0.05),Notch1和Hes1蛋白表达降低。结论:沉默NUF2表达可抑制卵巢癌细胞侵袭、迁移能力,其分子作用机制与抑制Notch信号通路有关。     

A longevity protein,Lag2, interacts with SCF complex and regulates SCF function

SCF‐type E3‐ubiquitin ligases control numerous cellular processes through the ubiquitin‐proteasome pathway. However, the regulation of SCF function remains largely uncharacterized. Here, we report a novel SCF complex‐interacting protein, Lag2, in Saccharomyces cerevisiae. Lag2 interacts with the SCF complex under physiological conditions. Lag2 negatively controls the ubiquitylation activities of SCF E3 ligase by interrupting the association of Cdc34 to SCF complex. Overexpression of Lag2 increases unrubylated Cdc53, whereas deletion of lag2, together with the deletions of dcn1 and jab1, results in the accumulation of Rub1‐modified Cdc53. In vitro rubylation assays show that Lag2 inhibits the conjugation of Rub1 to Cdc53 in competition with Dcn1, which suggest that Lag2 down‐regulates the rubylation of Cdc53 rather than promoting derubylation. Furthermore, Dcn1 hinders the association of Lag2 to Cdc53 in vivo. Finally, the deletion of lag2 combined with the deletion of either dcn1 or rub1 suppresses the growth of yeast cells. These observations thus indicate that Lag2 has a significant function in regulating the SCF complex by controlling its ubiquitin ligase activities and its rubylation cycle.     

人SCF非融合蛋白的纯化及生物活性

将构建的可溶性SCF表达质粒PBV-SCF转化到大肠杆菌DH5α中进行非溶合蛋白表达,经克隆筛选出高效表达菌株表达量在20％左右,大量扩增后经包涵体提取、液相层析技术纯化,得到纯度为90％以上的rh-SCF制品,对其等电点和N端氨基酸进行分析,证实具有天然SCF特性,生物活性检测表明该表达产物比活性为6.6×10⁵ U/mg, 同时可以协同GM-CSF促进人骨髓中CFU-GM增殖. 重组人可溶性SCF的获得对于实验室研究和临床应用具有一定价值.     

SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis

Many key activators and inhibitors of cell division are targeted for degradation by a recently described family of E3 ubiquitin protein ligases termed Skp1-Cdc53-F-box protein (SCF) complexes. SCF complexes physically link substrate proteins to the E2 ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34, which catalyses substrate ubiquitination, leading to subsequent degradation by the 26S proteasome. SCF complexes contain a variable subunit called an F-box protein that confers substrate specificity on an invariant core complex composed of the subunits Cdc34, Skp1 and Cdc53. Here, we review the substrates and pathways regulated by the yeast F-box proteins Cdc4, Grr1 and Met30. The concepts of SCF ubiquitin ligase function are illustrated by analysis of the degradation pathway for the G1 cyclin Cln2. Through mass spectrometric analysis of Cdc53 associated proteins, we have identified three novel F-box proteins that appear to participate in SCF-like complexes. As many F-box proteins can be found in sequence databases, it appears that a host of cellular pathways will be regulated by SCF-dependent proteolysis.     

Systemwide disassembly and assembly of SCF ubiquitin ligase complexes

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SCF和APC/C的结构及功能

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)是细胞周期进行的推动力,泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)通过对细胞周期蛋白(cyclin)和CDK抑制物(CDK inhibitors,CKIs)的蛋白质水解作用来实现对CDKs活性的调控。SCF(Skp1-Cul1-F-box protein)和APC/C(anaphase-promoting complex/cyclosome)这两个泛素连接酶复合物参与了很多细胞周期调节因子的泛素化作用。它们参与的蛋白质降解系统的功能失调可能导致细胞增殖紊乱、基因组不稳定和肿瘤的发生。现对这两个泛素连接酶复合物的结构以及它们在细胞周期调控和肿瘤发生机制中的作用进行综述。