黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达

构建了黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母YIp型载体pNEW4,通过与G418抗性质粒共转化,将糖化酶和木聚糖酶基因表达元件整合到多倍体酒精生产用酵母S. cerevisiae2.346染色体上,获得了整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11,研究了重组糖化酶和木聚糖酶在酵母工程菌中的表达及性质。     

黑曲霉木聚糖酶在工业酒精酵母中的分泌表达

用重叠延伸PCR方法从黑曲霉 (Aspergillusniger)UV 11的基因组DNA中克隆出木聚糖酶的cDNA基因 ,构建了由酵母乙醇脱氢酶 (ADH1)启动子和终止子引导表达、木聚糖酶自身信号肽引导分泌、rDNA序列介导的酵母整合型分泌表达质粒pAX2。用pAX2与酵母YEp型G4 18抗性质粒共转化野生型工业酒精酵母S .cerevisiae 2 346 ,获得了整合型分泌表达木聚糖酶的酵母重组菌株XY2。发酵分析表明该工程菌能够明显提高酒精生产率     

黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

从黑曲霉糖化酶高产株T2l合成的糖化酶cDNA,经5’端和3’端改造后克隆到酵母质粒YFDl8上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母a园子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌．实验还表明．黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。     

大麦α-淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将大麦α 淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA重组进同一大肠杆菌 酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体 pMAG1 5 .用原生质体转化法将 pMAG1 5引入酿酒酵母 (S .cerevisiae  GRF1 8) ,在酵母PGK基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下 ,实现大麦α 淀粉酶和糖化酶的高效表达 ,99%以上的酶活力分泌至培养基中 .构建的酿酒酵母菌株GRF1 8( pMAG1 5 )在含 1 5 %可溶性淀粉的培养基中 ,培养 47h能水解 99%的淀粉 ,并能发酵产生酒精     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

水解淀粉的酿酒酵母菌的构建

把黑曲霉糖化酶cDNA,酵母磷酸甘油激酶基因启动子区和终止区以及酵母Ty因子的δ序列构建成整合型的糖化酶表达分泌质粒pKG 1。该质粒转化酿酒酵母Y33得到整合型转化子。转化子分泌糖化酶活力在3.0μ/ml以上,在以5％可溶性淀粉为碳源的培养基中静止培养7d,淀粉利用率达86％,生成酒精的浓度与以5％葡萄糖为碳源时相等。     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母基因组中的整合及其在整合子中的稳定表达

把黑曲霉糖化酶cDNA连同酵母α因子启动子及其分泌序列,通过转化整合到酿酒酵母染色体DNA上,获得了整合型的分解淀粉酵母转化子。Southern印迹分析证明了糖化酶cDNA对酵母染色体DNA的整入。整合型转化子在以可溶性淀粉为碳源的培养基中分泌糖化酶活力达2．5u／m1,在非选择性培养基中连续转移10次．糖化酶分泌活力稳定不变。     

黑曲霉糖化酶cDNA的改造及其在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术扩增黑曲霉糖化酶cDNA不含非编码区50bp的5’端740bp的序列与该cDNA3’端1400bp的序列连接,获得切除了5’端非编码的糖化酶cDNA。将改造后的cDNA插到质粒pMA91的酵母PGK基因的启动子和转录终止信号之间,构建了含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pMAG17。用原生质体转化法将重组质粒pMAG17引入酿酒酵母GRF18。酿酒酵母GRF18转化子在淀粉平板上产生水解透明圈,表明糖化酶已在酵母中表达并分泌至培养基中。测定转化子的胞外酶活力及淀粉水解率。结果表明：改造后的糖化酶基     

植酸酶和甘露聚糖酶双功能毕赤酵母工程菌的构建和产酶分析

根据已发表的植酸酶基因和甘露聚糖酶基因序列设计并合成引物,应用PCR技术,分别以土曲霉总DNA和质粒pHBM1201为模板,扩增出均不含假定信号肽序列的植酸酶基因phyA和甘露聚糖酶基因man,将它们各自克隆到毕赤酵母表达载体pHBM907C上,分别得到重组质粒pHBM907C-phyA和pHBM907C-man。将质粒pHBM907C-phyA上由乙醇氧化酶(AOX1)启动子和终止子引导表达、酿酒酵母α信号肽序列引导分泌的phyA表达盒式结构插入到质粒pHBM907C-man中,构成双基因表达分泌质粒pHBM907C-phyA-man。pHBM907C-phyA-man经SalⅠ酶切线性后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得了同时分泌表达植酸酶和甘露聚糖酶的双功能酵母工程菌。研究了该酵母工程菌所分泌表达的重组植酸酶和甘露聚糖酶的相关酶学性质,并进行了双功能酵母工程菌的稳定性测试。     

α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母MF-α1因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97％的淀粉,重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

α－淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌．酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母基因组中的整合及其在整合子中的稳…

把黑曲霉糖化酶ｃＤＮＡ连同酵母ａ因子启动子及其分泌序列,通过转化整合到酿酒酵母染色体ＤＮＡ上,获得了整合型的分解淀粉酵母转化子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析证明了糖化酶ｃＤＮＡ对酵母染色体ＤＮＡ的整入。整合型转化子在以可溶性淀粉为碳源的培养基中分泌糖化酶活力达２．５ｕ／ｍｌ,在非选择性培养基中连续转移１０次,糖化酶分泌活力稳定不变。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

粉红黏帚霉糖化酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

用黑曲霉(Aspergillusniger)G1为宿主菌表达粉红黏帚霉(Gliocladiumroseum)糖化酶。运用PCR技术从粉红粘帚霉中扩增得到一个疑似糖化酶基因序列(约1.8 kb),并将其连接到载体p Gm上组建成重组质粒p Gm-3440。将重组质粒转化到黑曲霉G1菌株中,经amd S筛选及PCR验证获得表达糖化酶的黑曲霉重组工程菌。重组菌的发酵结果显示,糖化酶基因在黑曲霉中得到了分泌表达,用国标法(QB/T 1803-1993)测得重组糖化酶活性达292 U/m L。进一步对其酶学性质进行分析发现,该重组酶最适温度和p H分别为50℃和5.0,该酶的耐热性较差,p H稳定性较好。     

能分泌活性α-淀粉酶(鼠胰)的稳定的酵母转化株

将鼠胰α-淀粉酶的cDNA插入酵母穿梭质粒,并位于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MFα1基因编码序列的启动子和分泌信号肽的后面。经这种重组质粒转 化的啤酒酵母即能合成和分泌有活性的α-淀粉酶,该酶能有效地水解培养基中的淀粉。已从不同的酵母株系得到遗传稳定的分解淀粉的细胞株。意味着可用酵母直接转化淀粉原料为酒精,在生产上这是很有意义的一步。     

表达淀粉酶、糖化酶葡糖酸醋杆菌工程菌的构建

采用基因融合技术,将葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter hansenii ATCC23769分泌蛋白CMCax的信号肽序列分别与来源于枯草芽胞杆菌的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因融合构建融合蛋白,连入能在G.hansenii ATCC23769自主复制的载体pbs-H1S中,电击转入G.hansenii ATCC23769,构建能内源表达淀粉酶、糖化酶,以及淀粉酶-糖化酶的葡糖酸醋杆菌。淀粉平板透明圈检测结果和DNS测酶活结果显示,构建的3种工程菌能成功表达并分泌淀粉酶和糖化酶。     

猪磷脂酶A2基因在黑曲霉中的表达

目的:在黑曲霉中表达猪磷脂酶A2基因(PLA2、PLA2M)。方法:分别构建含有自身信号肽或糖化酶信号肽的猪磷脂酶A2基因PLA2重组表达载体pSZHG-PLA2、pSZHGS-PLA2M,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。结果:经筛选各得到1株同源重组转化子。对筛选出的同源重组菌株进行发酵培养,并进行胞内以及胞外酶活检测,结果显示由自身信号肽引导分泌的同源重组菌株的胞内和胞外酶活分别为21.68U/mL和2.12 U/mL,由糖化酶信号肽引导分泌的同源重组菌株的胞内以及胞外酶活分别为15.07U/mL和3.10U/mL。结论:表明在黑曲霉表达系统中自身信号肽和糖化酶信号肽都不能引导重组猪磷脂酶A2的有效分泌。     

黑曲霉糖化酶基因启动子区的克隆及其功能测定

利用PCR技术,以黑曲霉糖化酶高产株T21的基因组DNA为模板合成了糖化酶基因5＇端上游850bp的非编码区,并作了序列测定。将该合成片段与细菌潮霉素磷酸转移酶结构基因融合建成表达质粒,转化黑曲霉,获得了高潮霉素抗性转化子,证实该合成片段具有丝状真菌启动子功能。抗性转化子的Southern分析表明,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到受体黑曲霉的基因组DNA中。     

嗜热糖化酶基因在重组黑曲霉工程菌中的表达及酶学性质初步研究

为了提高糖化酶的耐热性能,降低淀粉糖化发酵工艺的生产成本,构建了同源整合载体pEasy-glaAdir以及pEasyssg,将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因(glaA)灭活,并将硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的嗜热糖化酶基因(ssg)插入到黑曲霉基因组中,筛选得到表达嗜热糖化酶的重组黑曲霉工程菌(A.nigerWW1)。重组菌的发酵结果显示,嗜热糖化酶在黑曲霉中得到了分泌表达,发酵液酶活达到3 030 U/mL。重组嗜热糖化酶的最适反应温度为90℃,最适pH为6.0,该酶具有较高的热稳定性,在80℃时的半衰期在60 min以上,具有良好的工业应用前景。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。