饲料中DHA含量对中华绒螯蟹幼蟹生长、脂类组成和低氧胁迫的影响

二十二碳六烯酸（C22:6n-3,DHA）对甲壳动物生长、蜕壳、性腺发育、免疫保护和抗环境胁迫具有重要的调节作用,探讨饲料中脂肪酸营养与中华绒螯蟹幼蟹生长和耐低氧胁迫的调控关系具有重要的理论意义和现实意义。通过单个体养殖试验、生化分析、低氧胁迫及生理指标测定等方法,研究了饲料中DHA含量对中华绒螯蟹幼蟹（初始均重为0.6g左右）成活、生长、脂类组成和低氧胁迫下生理指标的影响,探讨幼蟹饲料中适宜的DHA含量。结果表明:（1）饲料中DHA含量对中华绒螯蟹幼蟹的成活、生长、蜕壳和肝胰腺指数无显著影响;（2）饲料中DHA含量对幼蟹肝胰腺水分、肌肉水分及总脂含量均无显著影响,但饲料中过量DHA（0.81%）导致幼蟹肝胰腺总脂含量显著升高;（3）幼蟹肝胰腺和肌肉中的DHA均随着饲料中DHA含量升高而显著上升,但DHA相对保留率（组织中DHA与饲料中DHA的比值）随着饲料中DHA含量上升而显著下降,整体上肌肉中各PUFA的相对保留率远高于肝胰腺。无论饲料中DHA/EPA比值如何变化,肌肉中DHA/EPA均小于1,这说明幼蟹肌肉需要更多的EPA;（4）饲料中添加适量的DHA（0.18%0.28%）可以提高低氧胁迫下幼蟹血淋巴中超氧化物歧化酶的活性,降低其乳酸和丙二醛含量,从而提高幼蟹的抗低氧胁迫能力。综上,中华绒螯蟹幼蟹饲料中适宜DHA含量为0.2%左右。       

不同脂肪酸对中华绒螯蟹肝胰腺组织三种FABP表达的影响

本试验旨在研究不同脂肪酸水平对中华绒螯蟹肝胰腺中脂肪酸结合蛋白FABP3、FABP9和FABP10表达量的影响。取中华绒螯蟹肝胰腺组织进行体外培养,在液体培养基中分别加入50μmol/L、100μmol/L和250μmol/L 3种浓度的棕榈酸(PA),油酸(OA),亚油酸(LA),花生四烯酸(ARA),DHA和EPA 6种脂肪酸。分别在离体培养24 h后,运用Real-time PCR技术,研究组织内FABP3、FABP9和FABP10在不同种脂肪酸作用下的表达变化。研究表明,在培养基中加入100μmol/L、250μmol/L ARA后,FABP3的表达量显著性下调;而加入100μmol/L、250μmol/L亚油酸体外培养24 h后,FABP3的表达量显著性上调;在培养基中加入50μmol/L、100μmol/L、250μmol/LDHA、EPA、ARA和亚油酸体外培养24h后,都促进了FABP9基因的表达;在100μmol/L、250μmol/L亚油酸和ARA条件下,FABP10表达量发生显著性变化。FABP3、FABP9和FABP10的表达水平对脂肪酸的种类和浓度的不同反应,可能与实验动物所处的生理时期及对脂肪酸的需求有关。     

中华绒螯蟹对Pb和Cd的富集与释放特性

应用生物富集双箱动力学模型模拟了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)分别在Pb浓度为0.25、0.50、0.75mg/L,Cd浓度为0.025、0.050、0.075mg/L的单一水环境中暴露时,蟹鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴对Pb和Cd的生物富集与释放实验,并通过非线性拟合得到中华绒螯蟹对Pb和Cd的富集速率常数k1、排出速率常数k2、生物富集系数BCF、生物半衰期B1/2、富集平衡时生物体内Pb和Cd含量CAmax等动力学参数。结果表明:(1)中华绒螯蟹对Pb和Cd具有明显的富集,蟹鳃、肝胰腺和肌肉中Pb和Cd的含量与富集时间和水环境中Pb和Cd暴露浓度表现出了很好的正相关,血淋巴在富集阶段没有明显的规律。理论平衡状态下鳃、肝胰腺和肌肉中Pb和Cd含量CAmax随着暴露浓度的增大而增大,且成正相关。(2)Pb和Cd在中华绒螯蟹组织器官中的富集具有选择性,开始实验前,Pb在中华绒螯蟹体内的的分布规律为:肝胰腺>鳃>肌肉>血淋巴;Cd的分布规律为:鳃>肝胰腺>血淋巴>肌肉。在实验浓度的Pb和Cd水环境中暴露16d后,Pb的分布规律为:鳃>肝胰腺>肌肉>血淋巴;Cd的分布规律为:肝胰腺>鳃>肌肉>血淋巴。(3)中华绒螯蟹对Pb和Cd的生物富集和释放都较缓慢。经过16d的生物富集,各组织器官中Pb和Cd的含量均未达到稳态平衡。Pb和Cd在组织器官中的生物富集系数(BCF)范围分别为5-51和6-3148,中华绒螯蟹对Cd的富集能力明显高于Pb(P1/2)范围分别为4-9d和8-57d,中华绒螯蟹对Cd的排出能力明显低于Pb。       

不同阶段中华绒螯蟹肝胰腺的脂类及脂肪酸组成

研究了不同发育阶段中华绒螯蟹肝胰腺脂类及脂肪酸组成。结果表明：在卵巢快速发育阶段,肝胰腺数显著下降总脂的含量也略有降低,致使肝胰腺脂类的绝对量有显著的降低。未成熟和成熟中华绒螯的肝胰腺总分别为３４．３７％和２８．１３％。     

水生动物脂肪酸延长酶基因研究进展

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)对人类具有重要的生理作用,但由于人类缺乏从头合成这些脂肪酸的能力,而必须从食物中获得,鱼类等水生动物中二十碳五烯酸(20:5n-3,EPA)和二十二碳六烯酸(22:6n-3,DHA)等多不饱和脂肪酸含量丰富,从而使得鱼类等水生动物成为人们获得PUFAs的主要途径。鱼类等水生动物体内PUFAs的合成是在一系列去饱和酶和延长酶的作用下实现的,其中长链脂肪酸延长酶是合成PUFAs必不可少的一类关键酶。本研究总结了水生动物长链多不饱和脂肪酸合成的过程,综述了水生动物中脂肪酸延长酶基因的研究进展和未来的发展方向。     

育肥饲料中植物油混合替代鱼油对中华绒螯蟹雄体脂肪酸代谢相关基因表达的影响

为研究植物油替代鱼油对中华绒螯蟹(以下简称河蟹)脂肪酸代谢产生的影响, 通过荧光定量PCR (qRTPCR)技术研究了河蟹脂肪酸碳链延长酶(Es-FAE)、9脂肪酸去饱和酶(Es-FAD9)、6脂肪酸去饱和酶b (Es-FAD6b)、脂肪酸结合蛋白3 (Es-FABP3)、脂肪酸结合蛋白9 (Es-FABP9)和脂肪酸结合蛋白10 (Es-FABP10)基因在不同组织中的表达情况, 以及育肥饲料中不同鱼油替代水平(鱼油替代水平分别为0、25%、50%、75%和100%, 记为饲料1#5#组)对河蟹雄体肝胰腺中这些基因mRNA表达水平的影响, 以探讨育肥中鱼油替代对河蟹雄体成蟹脂肪酸代谢的影响。结果表明: (1) Es-FAE、Es-FAD6b和Es-FAD9均在肝胰腺中表达水平最高, 在心脏和血淋巴中表达水平较低, 不同基因在其他组织中的表达规律有所不同; Es-FABP3、Es-FABP9和Es-FABP10主要在肝胰腺、肌肉、输精管和副性腺中表达水平较高, 在胃、肠和心脏中表达水平较低。(2) 随着饲料中鱼油替代水平的提高, 肝胰腺中Es-FAE-mRNA有显著增加趋势; 就Es-FAD6b而言, 饲料3#组显著高于饲料2#组, 其余各组间差异不显著; 随着饲料中鱼油水平的降低, 饲料1#3#组肝胰腺中Es-FAD9-mRNA也有显著增加趋势, 但差异不显著。(3) 就Es-FABP3而言, 饲料2#和3#组肝胰腺中表达水平最高,且显著高于饲料1#组(P0.05), 其余各组间差异不显著; 随着鱼油替代水平的升高, 肝胰腺中Es-FABP9和Es-FABP10-mRNA水平均有先上升后下降趋势, 但各组间差异不显著。综上, 河蟹脂肪酸代谢和转运相关基因在肝胰腺中表达水平最高, 饲料中不同鱼油替代水平对肝胰腺中上述基因mRNA表达水平具有较大影响。     

低氧胁迫和螺原体感染对中华绒螯蟹存活和细胞凋亡的影响

为了探究低氧胁迫对螺原体(Spiroplasma eriocheiris)感染中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的影响, 以中华绒螯蟹为研究对象, 在低氧胁迫后, 取中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织加入组织固定液, 进行HE染色。在低氧条件下使螺原体感染中华绒螯蟹, 计算螺原体拷贝数, 并对血淋巴细胞进行细胞凋亡、细胞坏死和线粒体膜电位检测。结果显示, 与对照组相比, 处于长时间低氧胁迫状态下的中华绒螯蟹肝胰腺组织疏松, 出现大量小空泡, 鳃轴结构弥散, 组织结构被破坏。此外, 低氧组的中华绒螯蟹感染螺原体后的死亡速度相对于常氧组明显加快, 血细胞内的螺原体数量、线粒体膜电位、血细胞凋亡率和坏死率相较于常氧组均显著升高。以上研究说明低氧胁迫可以加速螺原体的感染, 使河蟹死亡速度变快, 使血淋巴细胞凋亡和坏死更显著, 不利于河蟹的生理生化。     

三疣梭子蟹软壳硬化阶段肝胰腺的营养成分及脂肪酸组成分析

采用常规营养物质测定方法和气质联用(GC-MS)技术,研究了三疣梭子蟹软壳硬化阶段肝胰腺的基本营养成分和脂肪酸组成。结果发现在其软壳硬化的过程中肝胰腺指数、粗脂肪和灰分含量逐渐降低,而粗蛋白含量趋势相反;表明脂类是主要的能源物质。共检测出42种脂肪酸,其中C16:0(棕榈酸)、C18:1(n-9)(油酸)和C22:6(n-3)(DHA)是主要脂肪酸;蜕壳后0～6 h,单不饱和脂肪酸(MUFA)在肝胰腺中的含量显著降低(P<0.05),而饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)的含量则均有不同程度的上升;6～48 h,MUFA在肝胰腺中的含量逐渐上升,PUFA的含量则与其相反;SFA在6～24 h时降低,随后升高;∑EPA+DHA在肝胰腺中的含量与∑PUFA的含量变化趋势一致。     

中华绒螯蟹水通道蛋白11基因克隆及表达分析

为研究水通道蛋白11基因(AQP11)在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生长蜕壳过程中的功能作用,采用RACE技术克隆获得中华绒螯蟹水通道蛋白11基因cDNA全长序列.该序列总长为1 746bp,5'端和3'端非编码区分别为463 bp和476 bp,开放阅读框为807 bp,推测编码268个氨基酸,预测分子量29.46 kDa,理论等电点为5.38.生物学信息分析表明,AQP11含有4个跨膜区(第62～84,第159～181,第194～216,第231～250)和2个NPV单元,属于稳定蛋白;同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹AQP11氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性最高(82.0％),与凡纳滨对虾的聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测显示,AQP11基因在中华绒螯蟹各组织中均有表达,其中在肠道中表达量最高,其次是脑、肌肉和胸神经节,在肝胰腺、鳃和血中表达量最低.研究发现,AQP11基因在中华绒螯蟹肠道中的表达呈现,在蜕壳间期(C期)和蜕壳前期(D期)过程中表达量均较低,在蜕壳期(E期)表达量开始上升,蜕壳后期(AB期)表达量不变.AQP11基因在肌肉中的表达呈现,蜕壳间期(C期)表达量低,蜕壳前期(D期)表达量开始上升,蜕壳期(E期)达到峰值,随后到蜕壳后期(AB期)下降.研究结果表明,中华绒螯蟹AQP11基因在其蜕壳过程中发挥着重要的作用.     

中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶基因克隆和真核表达系统的构建

Δ9-脂肪酸去饱和酶是多不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一,可催化脂肪酸链上特定位置形成双键。本研究在已克隆到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Δ9-脂肪酸去饱和酶(Δ9 fatty acyl-Co A desaturase,Δ9-FAD)基因基础上,为进一步了解其功能,根据中华绒螯蟹Δ9-FAD基因c DNA序列(accession number:JQ693685)以及真核表达载体p PIC3.5K,设计引物并在其上下游分别加入Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点;利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,构建重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD;利用电穿孔仪将经限制性内切酶SacⅠ线性化后的重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中。经筛选与PCR验证,得到含有重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD的毕赤酵母转化株。本实验成功构建了中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶的毕赤酵母表达系统,为深入研究Δ9-脂肪酸去饱和酶的功能做了基础性的工作。     

四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的超表达提高长链多不饱和脂肪酸生物合成效率

DHA(22:6n-3)、EPA(20:5n-3)和ARA(20:4n-6)三种长链多不饱和脂肪酸在生物体内活性最强,它们在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。然而,尽管哺乳动物体内有完整的长链多不饱和脂肪酸合成酶系,但哺乳动物合成这些长链多不饱和脂肪酸的效率很低而主要依赖于食物获取。本研究应用转基因方法,将哺乳动物来源的Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶这4种酶的编码基因构建成为一个多基因表达载体,然后转染哺乳动物细胞HEK293T,实现了4个目的基因的超表达,再通过气质联用(GC-MS)分析证实了DHA、EPA和ARA等长链多不饱和脂肪酸的合成效率及水平显著增加,DHA的水平更是提高了2.5倍。由此可见,哺乳动物具有某种抑制长链多不饱和脂肪酸高水平合成的机制,但通过Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的超表达,能够打破哺乳动物这种抑制机制,从而显著提高DHA、EPA、ARA等的合成水平。同时,本研究的思路也为在转基因动物中生产长链多不饱和脂肪酸提供了重要的启示。     

中华绒蟹幼体消化道甲壳质消化细菌的研究

1　引　　言随着中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)人工育苗规模的扩大 ,生产实践中有关小型甲壳类活体饵料投喂问题受到生产者和一些学者的重视[1,3 ,4] ,本研究分析中华绒螯蟹幼体消化道内甲壳质消化细菌 ,试图从该方面探讨中华绒螯蟹幼体与甲壳类活体饵料动物之间的关系 .有关水生动物消化道内甲壳质消化细菌 ,曾在鱼胃中有发现 .中华绒螯蟹消化道内微生物的研究未见有报道 ,我们对中华绒螯蟹 氵蚤Ⅰ大眼幼体消化道内甲壳质消化细菌进行了分离筛选 ,以探讨其消化机理 ,并为人工育苗生产中合理选择时机投喂卤虫 (Artemiasalina)、枝角类等…     

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）体内维生素C含量与死亡和产卵的关系

本文报道了中华绒螯蟹越冬后肝胰脏、肌肉和生殖腺维生素Ｃ的含量及变化。肝胰脏为中华绒螯蟹储存维生素Ｃ的器官;越冬后的雌性中华绒螯蟹,其肌肉和生殖腺的维生素Ｃ高于雄性;正常活动雌性或雄性,其肝胰脏、肌肉和生殖腺的维生素Ｃ含量均高于死亡的个体的维生素Ｃ含量;产卵且抱卵孵化的雌体,其肝脏维生素Ｃ的含量高于那些不产卵的雌体,维生素Ｃ含量的降低是越冬时或越冬后中华绒螯蟹死亡的主要原因之一。     

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）体内维生素C含量与死亡和产…

本文报道了中华绒螯蟹越冬后肝胰脏、肌肉和生殖腺维生素Ｃ的含量及变化。肝胰脏为中华绒螯蟹储存维生素Ｃ的器官;越冬后的雌性中华绒螯蟹,其肌肉和生殖腺的维生素Ｃ高于雄性;正常活动雌性或雄性,其肝胰脏、肌肉和生殖腺的维生素Ｃ含量均高于死亡的个体的维生素Ｃ含量;产卵且抱卵孵化的雌体,其肝脏维生素Ｃ的含量高于那些不产卵的雌体。维生素Ｃ含量的降低是越冬时或越冬后中华绒螯蟹死亡的主要原因之一。     

中华绒螯蟹卵巢RACB cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列,运用SMART技术,成功构建了中华绒螯蟹卵巢(Ⅲ期)RACE cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500—2000bP之间,RACE PCR结果表明,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物,说明所构文库的质量较好,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

长江下游狼山沙和新开沙中华绒螯蟹幼蟹栖息地评估

为探究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹栖息地适宜度状况,于2016年6月至2017年5月在长江下游狼山沙和新开沙放置定制网具,获取中华绒螯蟹幼蟹丰度分布特征及6个水环境因子,通过单因素方差分析、相关性分析和典范对应分析筛选出水深、透明度和无齿螳臂相手蟹(Chiromantes dehaani)丰度3个指示因子,建立栖息地适宜度曲线,计算栖息地适宜度指数(habitat suitability index,HSI)。结果表明:有水生植物站点的中华绒螯蟹幼蟹丰度较高;不同站点浊度、透明度和水深存在显著差异;中华绒螯蟹幼蟹丰度与无齿螳臂相手蟹丰度、水深极显著相关,与透明度显著相关;两沙洲有水生植物站点HSI值较高,均高于0.5,而其他站点普遍低于0.4,同时发现,中华绒螯蟹幼蟹偏好水深较浅、透明度10~20 cm、有水生植物覆盖的水域。研究表明,两沙洲适宜中华绒螯蟹幼蟹生长发育,应加大保护力度。     

中华绒螯蟹肉碱乙酰转移酶（CAT）基因表达分析

肉碱乙酰转移酶（CAT）是一种作用于短链脂肪酸的酶。本研究克隆了中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）CAT基因的开放阅读框序列（ORF）,并采用实时荧光定量PCR（q-PCR）分析其在雌雄不同组织中的表达模式以及不同卵巢发育时期肝胰腺和卵巢的表达变化。结果表明,CAT的ORF长为1 929 bp,编码642个氨基酸,无跨膜域和信号肽,预测的蛋白含有一个Acyltransferases ChoActase保守结构域（40 ~ 56 aa）,和一个Carn-acyltransf superfamily典型结构域（43 ~ 626 aa）。CAT在雌雄蟹所有组织中均有表达,雄蟹中肝胰腺和肌肉组织的表达量较高,在其他组织中的表达量相对较低;雌蟹中肝胰腺的表达量最高,其次为卵巢和肌肉。肝胰腺以及卵巢的CAT表达量在不同卵巢发育时期之间差异显著（P < 0.05）,表明CAT在卵巢发育过程中起着重要作用。     

低盐度海水和淡水对中华绒螯蟹性腺发育及交配行为的影响

研究了低盐度海水(盐度为15)和淡水(盐度为0)对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis,以下简称河蟹)性腺发育及交配行为的影响,并比较了河蟹交配和产卵前后的性腺指数及肝胰腺指数的变化。实验分为4组,分别为低盐度海水雌蟹组、淡水雌蟹组、低盐度海水雄蟹组和淡水雄蟹组。结果表明,(1)各组河蟹的成活率均在80%左右,无显著差异(P>0.05);(2)实验第15天、30天和45天时,低盐度海水雌蟹组的卵巢指数显著高于淡水雌蟹组(P<0.05),低盐度海水雄蟹组的性腺指数也略高于淡水雄蟹组,但差异不显著(P>0.05);(3)实验第30天时,低盐度海水雌蟹组的肝胰腺指数显著低于淡水雌蟹组(P<0.05),其余采样时间两组雌体间或两组雄体间的肝胰腺指数差异不显著(P>0.05),实验期间,两组雌体的肝胰腺指数均显著下降(P<0.05);(4)实验第45天,低盐度海水雌蟹组和雄蟹组实验个体全部能够交配,有66.7%的低盐度海水雌蟹组的个体交配后2 d内产卵,淡水雄蟹组有部分个体在低盐度海水中有发情行为;(5)低盐度海水组,雌蟹产卵后和雄蟹交配后的性腺指数均显著下降(P<0.05),但肝胰腺指数下降不显著(P>0.05)。     

中华绒螯蟹卵巢RACE Cdna文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

投喂不同油脂饲料对中华绒螯蟹免疫、代谢及耐低氧性能的影响

为研究饲料中添加鱼油和豆油对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)成蟹生长、免疫、代谢和耐低氧性能的影响,配制了添加不同比例鱼油和豆油的3种蟹用饲料,添加3%鱼油饲料组、3%豆油饲料组、3%鱼油和豆油混合组(1∶1,质量比),将其分别投喂中华绒螯蟹115 d后测量蟹体重、壳长和壳宽的变化,再将其放入溶解氧(dissolved oxygen,DO)为(9.06±0.06)mg/L和(2.57±0.44)mg/L的水体中,测定其免疫、代谢指标及耐低氧性能的变化。结果发现:投喂添加3种不同油脂饲料的中华绒螯蟹各组间体重无显著性差异;低氧胁迫对中华绒螯蟹代谢指标影响较大;添加鱼油和豆油混合油饲料组中华绒螯蟹血细胞密度、血蓝蛋白含量及超氧化物歧化酶、酸性和碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶的活性都为最高,说明鱼油与豆油混合添加对中华绒螯蟹免疫和抗氧化能力有促进作用,并增加其耐低氧能力。