意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

利用Bac to Bac系统将意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A₂（AmPLA₂）基因cDNA克隆至转移载体pFastBacHTa中,得到pBacHT-AmPLA₂,再将其转化入含穿梭载体Bacmid的受体大肠杆菌DH10Bac中,通过转座作用,得到含AmPLA₂基因的重组病毒rBacmid-AmPLA₂的DNA。提取其基因组DNA,用脂质体介导转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,得到重组病毒rACV-Bac-AmPLA₂。用此重组病毒感染Tn-5B1-4细胞, 在细胞中表达AmPLA₂。SDS-PAGE电泳结果显示,与6×His Tag融合表达的产物蛋白分子量约为18 kD左右,表达量约占细胞总蛋白的5.35%。Western blot印迹显示,融合表达产物能与意大利蜜蜂蜂毒AmPLA₂抗血清发生免疫反应。生物活性测定显示,含表达产物的细胞蛋白粗提物对底物蛋黄的酶活力约为6.13 μmol·min^-1·mg^-1。     

蜜蜂蜂毒主要成分与功能研究进展

蜜蜂蜂毒(honeybee venom)作为重要的蜂产品之一,其中的很多蛋白在抗炎、抗癌、抗菌、抗辐射和杀虫等方面具有很好的效果.20世纪40年代以来,国内外在蜂毒活性成分分析、作用机理、重要基因克隆和毒蛋白功能等方面进行广泛地研究,取得了重要的进展.本文的目的是总结蜜蜂蜂毒主要成分磷脂酶A2、透明质酸酶、蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽和镇静肽等毒蛋白的基因结构、生化特性及功能等方面的研究进展,为蜂毒基因的研究和利用提供一定的理论基础.     

人分泌型磷脂酶A2(hsPLA2-IIA)基因的克隆、表达及活性鉴定

目的为了构建人分泌型磷脂酶A2(secretaryphospholipaseA2,sPLA2-IIA)的有效表达系统,从胎脾中提取总RNA。方法采用RT-PCR方法扩增出编码sPLA2-IIA的基因定向地克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pET32a的TrxA基因3′末端,构建符合读码框的融合表达载体pET32a-sPLA2-IIA。37℃下经IPTG诱导,hsPLA2-IIA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体经8mol/L尿素溶解、复性后检测结果显示具有较高的催化活性并呈现剂量依赖关系。结论以大肠杆菌为宿主,成功表达了hsPLA2-IIA蛋白,为进一步进行hsPLA2-IIA的大量生产和功能研究奠定了基础。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

人分泌型磷脂酶A2(hsPLA2-IIA)基因的克隆、表达及活性鉴定

目的 为了构建人分泌型磷脂酶A2(secretary phospholipase A2, sPLA2-IIA) 的有效表达系统,本文从胎脾中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出编码sPLA2-IIA的基因定向地克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pET32a的TrxA基因3’末端,构建符合读码框的融合表达载体pET32a-sPLA2-IIA。37℃下经IPTG诱导,hsPLA2-IIA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体经8M尿素溶解、复性后检测结果显示具有较高的催化活性并呈现剂量依赖关系。结论：以大肠杆菌为宿主,成功表达了hsPLA2-IIA蛋白,为进一步进行hsPLA2-IIA的大量生产和功能研究奠定了基础。     

EXPRESSION OF A BEE-VENOM PHOSPHOLIPASE A2 FROM APIS CERANA CERANA IN E,.qCHERICHIA COLI

The venomous phospholipase A2 (AcPLA2) coding reading region of the Chinese honeybee (Apis cerana cerana), which is composed of 405 bp encoding a mature glycosylated peptide with 134 amino residues was transformed into the expression vector pETblue-1. Then the recombinant vector was introduced into Escherichia coli Tuner (DE3) plac I for expression. Analysis result of SDS-PAGE showed that the expression products had a protein band of about 15 kD. Detection of western blot using ant-European honeybee (Apis mellifera) phospholipase A2 (AmPLA2) polyclonal serum as the first antibody showed that the expression products appeared a special blot same as the native AmPLA2.The result demonstrated that the AcPLA2 peptide had been expressed in E. coli and the AcPLA2 has the similar antigenicity as the AmPLA2.     

鼠重组磷脂酶D2腺病毒的构建及功能的初步研究

将磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D2基因及其功能缺陷点突变基因 (K75 8R)从真核表达载体pCGN中克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中 ;再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组 ,成功构建磷脂酶D2重组腺病毒。该病毒颗粒感染人胚肾 2 93细胞 ,高效表达磷脂酶D2及其功能缺陷蛋白。这种表达对M3乙酰胆碱受体介导的细胞内磷脂酶D激活无影响。但磷脂酶D2功能缺陷蛋白对蛋白激酶C介导的胞内磷脂酶D激活有显著抑制作用 ;相反 ,磷脂酶D2蛋白有显著增强作用。结果表明     

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的溶血位点

用聚合酶链式反应 (PCR)对江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 基因进行点突变 ,使对应 34位氨基酸残基由Arg分别突变为Glu和Gln ,将其基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2 ,并在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 ,表达产物以包涵体的形式存在。对包涵体进行变复性后 ,用凝胶过滤的方法纯化。对纯化后的产物进行酶活力测定及溶血活性测定。实验结果表明 ,突变后的表达产物维持原有磷脂酶A2 活性 ,且溶血活性显著降低 ,表明磷脂酶A2 的34位碱性氨基酸残基在溶血过程具有重要作用     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的基因克隆、 表达及其生物学活性

利用 PCR 技术从金黄色葡萄球菌的基因组 DNA 中克隆 SEC2 全长基因, PCR 产物与 pGEM-T 载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体 pET-28a-SEC2 ,在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达成熟重组蛋白 (rSEC2) , 纯化 rSEC2 蛋白并对其生物学活性进行研究 . 结果表明：成功克隆了 SEC2 全长基因,测序证实该基因共 717 bp ,编码 239 个氨基酸,与 GenBank 中收录的 SEC2 成熟蛋白质序列完全一致, SEC2 基因登录 GenBank(Accession number ： AY450554) ; 构建了 SEC2 的表达载体 pET-28a-SEC2 ,并在大肠杆菌 BL21(DE3) 中得到高效可溶性表达,可溶性的 rSEC2 经 Ni²⁺ 亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的 rSEC2 蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被 rSEC2 刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用 .     

EXPRESSION OF A BEE-VENOM PHOSPHOLIPASE A2 FROM APIS CERANA CERANA IN ESCHERICHIA COLI

Abstract  The venomous phospholipase A₂ (AcPLA₂) coding reading region of the Chinese honeybee ( Apis cerana cerana ), which is composed of 405 bp encoding a mature glycosylated peptide with 134 amino residues was transformed into the expression vector pETblue-1. Then the recombinant vector was introduced into Escherichia coli Tuner (DE3) plac I for expression. Analysis result of SDS-PAGE showed that the expression products had a protein band of about 15kD. Detection of western blot using ant-European honeybee ( Apis mellifera ) phospholipase A₂ (AmPLA₂) polyclonal serum as the first antibody showed that the expression products appeared a special blot same as the native AmPLA₂.The result demonstrated that the AcPLA₂ peptide had been expressed in E. coli and the AcPLA₂ has the similar antigenicity as the AmPLA₂.     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4（AcerOBP4）编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法（Neighbor-joining,NJ）构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera OBP4（AmelOBP4）氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

中华蜜蜂工蜂王浆腺活性的变化

本试验以短期体外放射化学测定法,测定了中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂的王浆腺(HP)的活性,以意大利蜂(Apis mellifera ligustica)进行对比.结果表明工蜂的HP在体外培养液中1—6小时掺入的放射性DPM几乎呈直线增加.春夏繁殖期,中华蜜蜂7日龄工蜂的HP活性最强,而意大利蜜蜂是10日龄.中华蜜蜂的越冬工蜂的HP虽呈发育状态,但活性低.而在早春,当蜂群内部出现幼虫时,越冬工蜂的HP又呈现活性.     

中华蜜蜂精子介导egfp基因转移

中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种真社会性昆虫,也是我国重要的经济昆虫。本实验目的是为了检测精子是否可以作为载体将外源egfp基因介导转入中华蜜蜂。首先将雄蜂精子与线性化的质粒DNA共浴,然后通过人工授精技术将精子导入处女王,再对实验蜂群后代进行分析。结果显示EGFP蛋白在一群实验组蜂的1～2日龄小幼虫中表达较强,能检测到0.01%～0.02%荧光阳性小幼虫个体;通过PCR和RT-PCR技术分析,证实转入的外源egfp基因获得表达。实验结果表明精子载体法能够用于中华蜜蜂外源基因的转移和表达。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr170的克隆与序列分析

本研究采用自行设计的引物对中华蜜蜂Apis cerana cerana雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)Ac Or170的c DNA序列进行了克隆和序列分析,以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体Ac Or170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因Ac Or170的c DNA序列总长度为1356 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 k Da,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。     

中华蜜蜂气味受体AcerOR57的表达及定位分析

为研究中华蜜蜂气味受体AcerOR57的表达及定位,利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测气味受体AcerOR57 mRNA及蛋白在1日龄工蜂和雄蜂、采集蜂及性成熟雄蜂各部位(触角、头、胸、腹和足)的相对表达量;通过免疫组织化学技术检测该基因受体蛋白在中华蜜蜂触角中的表达定位。结果表明:AcerOR57转录本在1日龄工蜂和采集蜂,1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位均有表达,但表达程度不一:在1日龄工蜂、采集蜂的触角和1日龄雄蜂、性成熟雄蜂的头部中高丰度表达,均极显著高于其它部位(P0.01);Western blot结果显示,AcerOR57受体蛋白在1日龄工蜂和采集蜂触角中的表达量高于其它部位,这与荧光定量PCR结果相一致;但该蛋白在1日龄雄蜂和性成熟雄蜂的触角和头部表达均不明显,与mRNA水平表达结果相反;免疫组化结果显示,AcerOR57在工蜂和雄蜂触角的毛形感器、板形感器和锥形感器中表达。在1日龄工蜂和性成熟雄蜂中,毛形感器所占的比例大于板形感器,说明其主要在毛形感器中表达;在1日龄雄蜂和采集蜂中,板形感器的表达量比毛形感器表达量多,说明其主要在板形感器中表达;除采集蜂外,其它样本中均发现少量锥形感器的表达。推测AcerOR57可能在探测外界气味分子中发挥一定的作用,这为进一步研究气味受体的功能提供了理论依据。     

中华蜜蜂咽下神经节的结构和胚后发育

咽下神经节是昆虫腹神经索的第一个复合神经节, 主要调节口器附肢的活动。本研究通过形态解剖、 BrdU免疫组织化学等技术, 对中华蜜蜂Apis cerana cerana咽下神经节的组织结构和胚后发育过程进行了比较研究。结果表明： 中华蜜蜂的咽下神经节由上颚、 下颚和下唇3个神经节组成。在胚后发育过程中, 细胞增殖的活跃期主要集中在预蛹和蛹发育的第1天, 增殖活动一直持续到蛹发育的第4天结束。根据神经胶质细胞的位置和形态, 咽下神经节中的神经胶质可分为3种类型--表面神经胶质、 皮层神经胶质和神经纤维网神经胶质。本研究为蜜蜂神经系统的发育和功能研究提供了理论基础。