宽叶独行菜的化学成分研究

对宽叶独行菜不同物候期的蛋白质、１７种氨基酸进行了分析测定。同时对其不同器官中的蛋白质、氨基酸及１７种矿质元素和氨基酸含量的动态规律进行了研究,讨论了其作为青饲料的开发利用前景。     

中国独行菜族部分属种的叶表皮观察

利用光学显微镜对中国十字花科独行菜族部分广布属及相关属植物进行了叶表皮微形态学观察研究,结果表明:所研究的中国独行菜族植物叶表皮微形态具有多样性,可以划分为两种类型:第一类,叶上下表皮同形或近同形,叶表面被单毛或光滑无毛,包括独行菜属、群心菜属、菘蓝属和菥蓂属;第二类,叶上下表皮不同形,叶表面被分支毛和单毛,包括荠属和亚麻荠属;叶表皮微形态结果支持荠属应从独行菜族中移出,独行菜族是一多系类群,同时认为荠属与亚麻荠属植物具有较近的亲缘关系。     

基于rbcL和tufA基因的石莼和浒苔系统发育分析

本研究对海南沿岸采集到石莼(Ulva sp.)和浒苔(Enteromorpha sp.)的rbc L和tuf A基因序列进行PCR扩增并测序,并从Gen Bank下载16种绿藻的rbc L基因序列和tuf A基因序列,排序后的18种绿藻的rbc L基因长度为680 bp,变异位点416个,保守位点为264个。序列中C+G的含量为40.4%,说明浒苔属和石莼属的rbc L序列的(C+G)%值较低。而排序后的18种绿藻的tuf A基因长度为582 bp,变异位点122个,保守位点为460个。序列中C+G的含量为33.1%,说明浒苔属和石莼属的tuf A序列的(C+G)%值较低。利用NJ法以rbc L和tuf A序列构建的系统进化树表明,浒苔属和石莼属的物种并未聚类成各自独立的进化枝,而是存在明显的属间交叉分布现象。     

独行菜种子转录组的高通量测序及分析

独行菜种子为我国传统常用中药,从中已提取出多种药用活性成分,但目前尚不清楚其次级代谢过程中这些活性物质合成的遗传基础。采用Illumina Hiseq^TM 2000高通量测序平台对独行菜种子转录组进行测序,经de novo组装后获得40 303条unigene。进一步利用六大公共数据库进行同源比对,注释了27 935条unigene。研究发现,534个基因参与了独行菜次生物质的合成和代谢,其中在芥子苷、黄酮类和芪类化合物生物合成途径中的unigene分别有4个、19个和69个,在苯丙氨酸代谢途径中的unigene有92个。这些基因可能参与独行菜种子药性活性物质的生物合成,并分析获得了参与上述合成代谢途径的13个关键基因的同源序列。另外,从转录组序列中搜索到6 304个SSR位点,分布于5 306条unigene中,出现频率为15.64%。研究结果不仅为挖掘独行菜种子药用次生代谢物生物合成关键基因提供了基础数据信息,而且为独行菜遗传多样性研究和分子标记开发奠定了分子基础。     

大黄鱼与小黄鱼细胞色素b基因全序列的比较分析

对大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞色素b基因进行了PCR扩增及序列测定,得到1140bp的全序列。大黄鱼和小黄鱼的碱基组成相似,前者T、C、A、G含量分别为28.4%、33.0%、23.2%和15.4%,A+T含量为51.6%;后者T、C、A、G含量分别为26.7%、34.1%、23.8%和15.4%,A+T含量为50.5%。大、小黄鱼cytb基因中三联体密码子中碱基的使用频率很相似,第一位较均一,第二位富含T,第三位富含C。大小黄鱼cytb基因存在明显差异,序列相似性仅为88.95%;两序列间具有126个差异位点;碱基转换/颠换率为3.1,碱基替换多发生在密码子第三位;碱基转换中C\T显著高于A\G,表现出转换偏歧。     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

蓝狐-卫星DNA的克隆及序列分析

利用限制性内切酶酶切蓝狐基因组, 经琼脂糖凝胶电泳, 对特异性亮带进行克隆、测序及序列分析。结果获得42个卫星DNA序列, 该卫星DNA单体大小为737 bp, G+C含量为51.9%, 单体之间同源性为91%~97%; 每个单体由3个约245 bp的亚重复串联构成, 亚重复之间的同源性为49%~55%; 在物种进化过程中, 该卫星DNA有G+C含量逐渐降低而A+T含量逐渐上升的趋势; 该卫星DNA为犬科动物种属所特有, 与犬着丝粒相关卫星DNA为同类卫星DNA, 同源性为74%, 命名为α-卫星DNA。     

独行菜LaMCT基因的克隆、序列分析与原核表达

强心苷作为药用植物独行菜( Lepidium apetalum)的活性成分,其化学和药理学研究已有良好的基础,但其生物合成途径目前仍不清楚。该研究以独行菜幼苗为材料,通过分析独行菜转录组数据,设计特异性引物,PCR扩增得到了强心苷生物合成MEP途径的关键酶2-C-甲基赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶( MCT)基因的开放阅读框( ORF),命名为LaMCT( Genbank注册号KT832554),并进行序列分析和原核表达。序列分析结果表明：LaMCT基因ORF全长为912 bp,编码304个氨基酸。亚细胞定位和保守结构域分析结果表明：LaMCT蛋白位于叶绿体中,不含信号肽,没有跨膜区,含有类异戊二烯合成酶保守结构域( isoprenoid synthase domain)。系统进化树结果表明：LaMCT蛋白与拟南芥的MCT蛋白具有94％的序列相似性,亲缘关系较近。通过构建pET-32a-LaMCT原核表达载体,成功在大肠杆菌BL21( DE3)菌株中诱导表达LaMCT重组蛋白,并得到了纯化的LaMCT重组蛋白。该研究首次从独行菜中克隆了LaMCT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaMCT蛋白抗体的制备以及研究LaMCT基因在独行菜强心苷类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

宽叶独行菜中脂肪酸的GC-MS分析

采用气质联用技术对宽叶独行菜中脂肪酸成分进行了分析,从其乙醇提取物的石油醚萃取部分共分离得到20个组分,采用面积归一化法测定了各组分的含量,其中棕榈酸(hexadecanoic acid)53.980%,硬脂酸(oc-tadecanoic acid)17.063%,二十二烷酸(docosanoic acid)4.769%,二十四烷酸(tetracosanoic acid)3.363%,二十八烷酸(octacosanoic acid)2.773%,花生酸(eicosanoic acid)2.719%,十五烷酸(pentadecanoic acid)2.476%,十七烷酸(heptadecanoic acid)2.291%。此外,三十烷酸(triacontanoic acid,十四烷酸(tetradecanoic acid),二十三烷酸(tricosanoic acid)和二十六烷酸(hexacosanoic acid)的含量均已超过了1%。     

叶甲亚科部分种类COⅡ基因序列分析及系统发育初探

以线粒体COⅡ基因作为分子标记,对叶甲亚科4种昆虫进行序列测定,获得该基因585 bp的序列片段,并结合GenBank中的8种同源序列进行分析,结果表明:12种叶甲序列片段变异率为45.6%,碱基T、C、A、G的平均含量分别为37.5%、16.5%、35.3%和10.7%, A+T平均含量为72.8%,明显高于G+C含量(27.2%).密码子第3位点A+T含量高达86.7%.碱基替换主要发生在C←→T和A←→T之间,第3位点的替换频率显著高于前两个位点.以中华萝摩叶甲Chrysocus chinensis为外群构建的系统发育树显示,金叶甲属和角胫叶甲属关系较近,弗叶甲属和叶甲属关系较近,圆肩属形成一个单系,位于系统树的基部,它们之间的关系为(圆肩属+(弗叶甲属+叶甲属)+(金叶甲属+角胫叶甲属)).属内种间的关系反映出叶甲的食性专化现象与其在分类系统上的地位是密切相关的.     

闽浙地区香鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区序列多态性分析

对浙江瑞安、福建宁德、福建东张水库3个地理群体共31例香鱼(Plecoglossus altivelis)的线粒体细胞色素b(Cyt b)基因和线粒体D-loop区序列进行了PCR扩增、序列测定、核苷酸组成和多态性分析。Cyt b基因中, A、T、C和G 4种核苷酸的比例分别为19.72%、29.71%、32.25%和18.32%, A + T含量为49.43%, G + C含量为50.57%。D-loop区序列中, A、T、C和G 4种核苷酸的比例分别为29.99%、29.29%、23.80%和16.92%, A + T含量为59.28%, G + C含量为40.72%。在长度为1 141 bp的Cyt b基因序列中, 仅存在1个变异位点, 核苷酸多样性指数(π值)为0.00028, 31个样本中仅出现两种单倍型; 857 bp长的D-loop区序列中, 仅存在5个变异位点, 核苷酸多样性指数(π值)为0.00199, 仅出现5种单倍型。这表明闽浙地区香鱼的遗传多样性水平很低, 应当加大对香鱼的保护力度。     

基于psaA和psbA基因的红索藻目系统发育研究

对红索藻目植物棘刺红索藻(Thorea hispida)的psaA和psbA基因进行扩增和测序,并与其它类群比对分析,分别用最大简约法、邻接法和贝叶斯法构建系统发育树。结果显示,psaA和psbA基因测得的序列片段分别为825和920 bp,psaA基因A、T、C、G碱基含量分别为29.9%、35.8%、16.5%和17.8%,psbA基因A、T、C、G碱基含量分别为27.5%、35.3%、16.8%和20.4%,两个基因A+T含量均高于C+G含量,说明两个基因在进化上均有碱基的偏好性。用3种方法所构建的系统树拓扑结构基本一致,红索藻目植物均聚合于一个分支,独立于其它类群,支持红索藻目为一独立的目。     

独行菜种子bHLH类转录因子基因家族及幼苗laICE1表达对冷胁迫的响应

该研究在转录组数据基础上,以独行菜(Lepidium apetalum Willd.)种子耐受和不能耐受低温萌发的2组样本为材料,对其bHLH转录因子家族成员进行分析,并对该家族成员表达差异极显著的laICE1基因进行克隆、序列分析、结构预测,以探讨独行菜幼苗中laICE1基因表达对低温胁迫的响应特征。结果表明:(1)萌发中的独行菜种子,至少有83个bHLH转录因子序列表达,相对于低温萌发停滞组,在低温萌发耐受组的独行菜种子中,有10个下调、13个上调、60个表达差异不显著。其中表达量极显著下调的序列c20009_g1具有1 503bp开放阅读框,GO注释到ICE1基因,该基因命名为laICE1。(2)laICE1基因编码500aa,蛋白分子量为54 635.19kD,理论等电点为5.45,分子式为C2364H3742N688O758S22;该蛋白具有保守结构域bHLH。(3)定量分析表明,laICE1基因在非低温胁迫的独行菜种子中的表达量显著低于一直处于低温胁迫中不能进行萌发的独行菜种子,这与转录组数据库中该序列表达情况一致;而laICE1基因在独行菜幼苗期经低温处理后,其表达量显著上调,表明laICE1基因可能在独行菜幼苗耐受低温生长中具有一定的作用。     

基于线粒体COⅠ基因的齿小蠹属昆虫DNA条形码研究

齿小蠹属（鞘翅目： 小蠹科）昆虫是植物检疫中经常截获的类群, 为探讨线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特定区段作为DNA条形码快速准确鉴定齿小蠹种类的可行性, 以齿小蠹属昆虫为研究对象, 测定分析了线粒体COⅠ基因462 bp碱基序列。序列分析结果显示： 变异位点为259个, 保守位点203个, 简约信息位点181个, 自裔位点78个。所有位点中, A, G, C和T碱基平均含量分别为30.7%, 16.5%, 17.0%和35.8%。A+T含量较高, 为66.5%, 明显高于G+C含量, 表现明显的A+T碱基偏嗜, 且A与T含量相当, 符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。转换与颠换结果显示： 该段序列未达到饱和, 可以得到准确的进化分析。利用Kimura 2-parameter模型分析遗传距离得到, 同物种间的遗传距离介于0.002~0.007之间, 不同种间的遗传距离介于0.056~0.431间, 平均遗传距离为0.199, 说明该段序列能够区分不同物种。基于COⅠ基因序列构建的邻接法系统发育树（NJ树）显示, 同一物种聚为同一小支, 且分支自展值均为100%; 近缘种能聚集在一起, 且置信度很高（≥97%）。结果表明应用基于COⅠ基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属昆虫分类鉴定具有可行性。     

抱茎独行菜种皮粘液质相关基因TTG1的克隆、表达分析及功能鉴定

抱茎独行菜（Lepidium perfoliatum L.）为十字花科具典型粘液质繁殖体植物,而TTG1基因（Transpa-rent testa glabra 1）所编码的蛋白是调控种皮细胞分化并影响粘液质释放的转录因子。目前关于TTG1基因在粘液质繁殖体植物中的研究报道较少,为探究TTG1基因在抱茎独行菜粘液质发育中的作用,本研究利用同源克隆技术获得抱茎独行菜TTG1基因cDNA开放阅读框（ORF）序列,命名为LpTTG1。序列分析表明,该基因ORF全长为1032 bp,编码343个氨基酸,含有WD40基序;qRT-PCR分析结果显示,该基因在抱茎独行菜各组织中均有表达,反映了该基因功能的多样性;免疫组织化学定位结果表明,LpTTG1在种子发育过程中内珠被和外珠被的表达水平变化与外珠被粘液质的合成过程相一致,推测该基因可能参与调控抱茎独行菜种皮的发育及粘液质的形成。将LpTTG1基因转化拟南芥,该基因的过量表达显著促进了粘液质合成途径下游基因AtMUM4在角果中的表达,表明该基因有可能参与粘液质合成途径调控,并促进下游产物MUM4的产生。然而,对LpTTG1转基因拟南芥与野生型植株表型的比较发现,两者种子形态及粘液质分泌与释放方式均无显著差异,这可能是因为抱茎独行菜种皮发育和粘液质形成是一个多基因调控的复杂过程,某一基因的过量表达也许不会引起明显的表型变化。     

白腹鹭CO I和Cyt b基因序列分析及鹭属系统发育研究

白腹鹭Ardea insignis数量稀少,被世界自然保护联盟列为极危(CR)物种,关于该物种的生态信息和分子生物学研究极少。本研究通过扩增得到了白腹鹭的2个线粒体基因序列(CO I和Cyt b),Cyt b基因序列长度为1 163 bp,其中的A+T含量(51.7%)高于C+G(48.3%),第三位点上碱基偏倚最突出;CO I基因序列长度为722 bp,A+T含量(52.5%)高于C+G(47.5%),碱基偏倚同样在第三位点最明显。结合来自Gen Bank鹭属Ardea其他6个物种的CO I和Cyt b基因序列,构建鹭属的系统发育树,结果表明,鹭属7种鸟类构成单系,后验概率支持度为96%,大白鹭A.alba和白腹鹭在鹭属中是较早分化出的类群,位于鹭属分支的基部;白腹鹭与草鹭A.purpurea的遗传距离最近。     

LaHY5基因对独行菜下胚轴低温伸长的影响

独行菜种子下胚轴伸长存在低温停滞现象,是研究温度对植物下胚轴伸长影响的良好材料。为了揭示下胚轴伸长相关转录因子HY5在独行菜下胚轴低温伸长中的作用,该研究从独行菜种子转录组中获得LaHY5序列,并进行了克隆、序列分析,通过实时定量PCR技术研究了该基因表达与低温诱导及萌发阶段的关系,并通过转化拟南芥分析该基因表达对下胚轴低温伸长的影响。结果表明:(1)LaHY5基因的cDNA序列包含447 bp的完整阅读框序列,其编码产物为富含丝氨酸的149个氨基酸组成的肽链,包含典型的BRLZ结构域,相对分子质量为16.830 kD,分子式为C_(692)H_(1156)N_(228)O_(246)S_7,理论等电点为8.73,与十字花科植物同源序列高度一致。(2)LaHY5基因在独行菜萌发过程中的种子或幼苗中受低温诱导快速上调表达。(3)转LaHY5基因拟南芥种子在常温或低温条件下,下胚轴伸长均比野生型植株快。研究表明,LaHY5转录因子在种子低温萌发及幼苗耐受低温胁迫中起重要作用,但LaHY5基因并不是造成独行菜下胚轴伸长低温停滞的限制性因素。     

五种色蟌Cyt b基因序列及其系统发育关系

以昆虫mtDNA的Cytb基因作为分子遗传标记,用其特异性引物进行PCR扩增及DNA测序,共获得蜻蜓目束翅亚目色蟌科4属5种及1外群的Cytb基因部分序列(576bp),该片段中碱基T,C,A,G的平均含量分别为31.6,21.6,31.4和15.4%,A+T平均含量为63%,明显高于G+C含量(37%)。密码子第3位点的A+T平均含量较高,为66.4%。碱基替换多发生在密码子的第3位点。以巨齿尾溪蟌Bayadera melanopteryx作为外群构建系统发育树,结果显示,绿色蟌属Mnais和单脉色蟌属Matrona是单系群,绿色蟌属是单脉色属、细色蟌属Vestalis及艳色蟌属Neurobasis的姐妹群,是较早分化出来的一个类群。     

天然三倍体鲫鱼突变体萍乡肉红鲫线粒体细胞色素b基因序列分析

用细胞色素b(Cyt b)基因特异性引物,对萍乡肉红鲫(Carassius auratus var.pingxiangnensis)的线粒体Cyl b基因进行PCR扩增和双向测序.在12个个体中均得到序列一致的Cyt b基因全序列,长度为1 140 bp.其A、T、G、C含量分别为28.2%(321)、28.8%(328)、14.8%(170)和28.2%(321),A+T含量(57%)明显高于G+C含量(43%).与其他水生动物相同基因片段碱基含量相似.该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡;第2位核苷酸中T的使用率较高,为41.8%,G的使用率较低,为13.2%;密码子第3位A的使用率较高,为39.7%,而G的使用率较低,仅为6.3%.BLAST结果显示,萍乡肉红鲫与其他鲫鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性,其中与银鲫(C.a.gibelio)的相似性为93%,与普通鲫鱼(C.carassius)的相似性为98%.邻接法构建的分子系统进化树表明,萍乡肉红鲫与普通鲫鱼亲缘关系最近.