黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及细胞因子表达的影响

目的：探讨黄芪甲苷对人骨髓间充质干细胞体外增殖及细胞因子表达的影响。方法：采用Percoll密度离心法和贴壁法分离纯化hBMSC;流式细胞术检测hBMSC表面标志;MTT法检测不同浓度黄芪甲苷干预72h后hBMSC的增殖情况;Real-timePCR法检测经黄芪甲苷干预后hBMSC对SCF、VEGF、SDF-1、GM-CSFmRNA的表达水平。结果：成功分离培养出laBMSC;不同浓度（20、40、80、160、320mg／mL）的黄芪甲苷可促进hBMSC增殖（P〈0．05）,其中160mg／mL组促增殖最明显;黄芪甲苷可促进hBMSC对SCF、VEGF、SDF-1mRNA的表达,而GM—CSFmRNA表达无明显变化。结论：黄芪甲苷可促进hBMSC体外增殖,可能与其促进hBMSC对SCF、VEGF、SDF-1mRNA表达有关。     

黄芪甲苷对马兜铃酸诱导的巨噬细胞M1型极化的作用及机制研究

目的:探讨黄芪甲苷对马兜铃酸诱导的RAW264.7细胞向M1型极化的影响,并初步探索其可能的作用机制。方法:分别采用马兜铃酸和脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞24 h,伴或不伴黄芪甲苷进行药物干预处理。采用细胞计数检测试剂盒-8(CCK 8)检测细胞活性变化,流式细胞仪检测巨噬细胞分型,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量。反转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测RAW264.7细胞IL-6、TNF-αmRNA表达。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测RAW264.7细胞p-p38和p38 MAPK蛋白表达水平。结果:CCK8结果提示黄芪甲苷在5~50μg/mL浓度范围对RAW264.7巨噬细胞无明显毒性,本研究选取10μg/mL作为实验干预浓度。黄芪甲苷能够显著改善马兜铃酸诱导的巨噬细胞活性(P<0.05),同时减少IL-6和TNF-α的分泌水平和mRNA表达水平(均P<0.05),抑制马兜铃酸和LPS诱导的M1/M2巨噬细胞比例(P<0.05)。黄芪甲苷可部分抑制马兜铃酸诱导的巨噬细胞p38 MAPK磷酸化水平(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可减少巨噬细胞M1型极化,降低炎症因子IL-6和TNF-α水平,减少巨噬细胞的活性,从而起到减缓马兜铃酸肾损害的作用,其作用机制可能与部分抑制p38 MAPK信号活性有关。     

黄芪甲苷激活TGF-?茁1/Smad2信号通路诱导骨髓间充质干细胞向周细胞分化的作用研究

摘要 目的：观察黄芪甲苷促进大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法：本研究以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,采用全骨髓培养法,从SD大鼠乳鼠（5d-7d）股骨提取原代细胞,体外传代纯化,P4-P5代用于实验。实验分阴性对照组,大鼠BMSCs 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法：本研究以大鼠骨髓间培养基培养,不给予药物干预;阳性对照组,给予转化生长因子β1(TGF-β1) 5 ng/mL干预3天;黄芪甲苷(Astragaloside,Ast) 组,给予黄芪甲苷4 μg/mL分别干预1 d、2 d、3 d、5 d、7 d;阻断剂组,TGF-β1 受体阻断剂 sb431542 预处理后,再加入黄芪甲苷4 μg/mL分别诱导1 d、2 d、3 d。实时定量PCR( RT-PCR) 检测神经元-胶质细胞抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)、α-平滑肌肌动蛋白( alpha smooth muscle actin,α-SMA )信使核糖核酸(mRNA)表达;印迹法(Western blot) 检测NG2、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2蛋白表达。结果：经黄芪甲苷诱导刺激后,大鼠骨髓间充质干细胞在mRNA和蛋白水平上,NG2、α-SMA 的表达量均升高;Ast 3d组,与阴性对照组和阳性对照组相比,NG2、?-SMA蛋白和mRNA的表达量均显著升高(p<0.05)。黄芪甲苷刺激细胞后,TGF-β1/Smad2信号传导通路被激活,从第一天开始,p-Smad2蛋白表达量升高,第3天到达顶峰,随后降低;其中第三天,p-Smad2蛋白表达量显著高于Ast 0d组(p<0.01) 。加入阻断剂后,黄芪甲苷受到 sb431542影响,对细胞的作用减弱,NG2、α-SMA蛋白和mRNA表达量均下调;sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,NG2、α-SMA 蛋白和mRNA的表达量显著降低(p<0.001)。受阻断剂的影响,黄芪甲苷对TGF-β1/Smad2信号传导通路的作用减弱,前三天p-Smad2蛋白的表达量均降低,sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,p-Smad2蛋白的表达量显著降低(p<0.001)。结论：黄芪甲苷具有促进大鼠BMSCs向周细胞分化的作用,其机制与激活TGF-β1/Smad2信号传导通路相关。     

VEGF和SDF-1 的协同作用对内皮祖细胞增殖与迁移的影响

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和基质衍生因子-1(SDF-1)的协同作用对高血压脑出血患者内皮祖细胞(EPCs)增殖迁移能力的影响。方法:采集急性期高血压脑出血患者与健康对照的外周静脉血,分离培养外周血中的EPCs。用分别含有不同VEGF与SDF-1的培养基处理患者外周血分离的EPCs,Western blot检测各组细胞以及患者和对照中VEGF和SDF-1的蛋白表达。MTT法检测细胞增值能力,Transwell法检测细胞迁移能力,分别转染VEGF-si RNA与SDF-1-si RNA至各组细胞观察抑制VEGF和SDF-1对EPCs增殖迁移能力的影响。结果:VEGF和SDF-1在患者中的表达显著高于健康对照组。VEGF和SDF-1对EPCs的增殖和迁移能力有促进作用,且在其协同作用下效果显著。抑制VEGF或SDF-1显著降低VEGF和SDF-1对EPCs增殖迁移能力的促进作用。结论:VEGF和SDF-1的协同作可促进急性期高血压脑出血患者EPCs的细胞增殖能力和迁移能力,对患者血管修复提供新的治疗方向。     

黄芪甲苷激活TGF-β1/Smad2信号通路诱导骨髓间充质干细胞向周细胞分化的作用研究

目的:观察黄芪甲苷促进大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,采用全骨髓培养法,从SD大鼠乳鼠(5d-7d)股骨提取原代细胞,体外传代纯化,P4-P5代用于实验。实验分阴性对照组,大鼠BMSCs 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)向周细胞分化的作用,揭示中药黄芪治疗缺血性心脏病的意义。方法:本研究以大鼠骨髓间培养基培养,不给予药物干预;阳性对照组,给予转化生长因子β1(TGF-β1)5 ng/mL干预3天;黄芪甲苷(Astragaloside,Ast)组,给予黄芪甲苷4μg/mL分别干预1 d、2 d、3 d、5 d、7d;阻断剂组,TGF-β1受体阻断剂sb431542预处理后,再加入黄芪甲苷4μg/mL分别诱导1 d、2 d、3 d。实时定量PCR(RT-PCR)检测神经元-胶质细胞抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)信使核糖核酸(mRNA)表达;印迹法(Western blot)检测NG2、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2蛋白表达。结果:经黄芪甲苷诱导刺激后,大鼠骨髓间充质干细胞在mRNA和蛋白水平上,NG2、α-SMA的表达量均升高;Ast 3d组,与阴性对照组和阳性对照组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量均显著升高(p0.05)。黄芪甲苷刺激细胞后,TGF-β1/Smad2信号传导通路被激活,从第一天开始,p-Smad2蛋白表达量升高,第3天到达顶峰,随后降低;其中第三天,p-Smad2蛋白表达量显著高于Ast 0d组(p0.01)。加入阻断剂后,黄芪甲苷受到sb431542影响,对细胞的作用减弱,NG2、α-SMA蛋白和mRNA表达量均下调;sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,NG2、α-SMA蛋白和mRNA的表达量显著降低(p0.001)。受阻断剂的影响,黄芪甲苷对TGF-β1/Smad2信号传导通路的作用减弱,前三天p-Smad2蛋白的表达量均降低,sb431542+Ast 3d组,与Ast 3d组相比,p-Smad2蛋白的表达量显著降低(p0.001)。结论:黄芪甲苷具有促进大鼠BMSCs向周细胞分化的作用,其机制与激活TGF-β1/Smad2信号传导通路相关。     

缺氧环境下MSCs促进血管内皮细胞增殖和血管形成

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)在体外缺氧环境下对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖和血管形成能力的影响及其可能机制.方法密度梯度离心法收集分离成人骨髓血MSCs并进行体外培养扩增,传代至4代进行实验,流式细胞仪鉴定MSCs表面标志.BMSCs缺氧培养0h(对照组)、12h、24h和48h后,RT-PCR检测SDF-1和VEGF基因表达,ELISA法检测细胞上清液中SDF-1和VEGF蛋白含量.HUVECs传代培养后分成三组进行实验:对照组、BMSCsCMN-HUVECs组,BMSCsCMH-HUVECs组,MTT检测三组细胞增殖能力,体外血管形成实验分析三组细胞在Matrigel上管腔样结构形成情况.结果 (1) BMSCs呈旋涡状长梭形即纤维母细胞样生长;(2) 人BMSCs阳性表达CD29、CD44和CD90,而CD34、CD45和CD106为阴性;(3) BMSCs缺氧培养后SDF-1和VEGF在mRNA和蛋白水平表达均较常氧培养显著增高(P均<0.05);(4) BMSCsCMH明显提高HUVECs增殖能力(P<0.05),显著增加HUVECs在Matrigel上形成管腔样结构的能力(P<0.05).结论 人BMSCs在缺氧环境下通过旁分泌SDF-1和VEGF提高血管内皮细胞增殖和管腔样结构形成能力,促进血管新生.     

土贝母苷甲经miR-21/ PDCD4 途径诱导胶质瘤U251细胞凋亡

目的:研究土贝母苷甲(TBMS I)对胶质瘤U251细胞的抗肿瘤作用以及探究土贝母苷甲对miR-21及其靶基因PDCD4基因表达的影响。方法:U251细胞在体外进行培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的土贝母苷甲对细胞增殖的影响;Hoechst33258染色观察细胞核形态的变化;实时荧光定量PCR检测miR-21和PDCD4基因的表达情况;Western blot检测PDCD4蛋白的表达情况。结果:土贝母苷甲能够显著抑制U251细胞的增殖,其抑制作用呈剂量和时间依赖性。Hoechst33258染色观察到土贝母苷甲处理组细胞的细胞核形态表现出典型的凋亡特征。PCR结果显示:随着土贝母苷甲浓度增加,miR-21的表达逐渐降低(P0.05),PDCD4基因表达显著增加(P0.05)。Western blot结果提示:与阴性对照组相比,15、30μg/mL土贝母苷甲显著上调了PDCD4蛋白的表达(P0.05)。结论:土贝母苷甲能够显著抑制人胶质瘤U251细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡,其机制可能与下调miR-21的表达和上调PDCD4的表达有关。     

苦参碱对鼻咽癌细胞凋亡及凋亡相关基因p53的表达研究

目的：探讨苦参碱对体外培养的人鼻咽癌细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因p53 mRNA和蛋白表达的影响,初步探讨苦参碱诱导人鼻咽癌细胞凋亡的可能机制。方法：采用MTT法检测不同浓度苦参碱（0、0.25、0.5、1、1.5、2 mg/ml）对CNE1、CNE2细胞增殖的影响;采用荧光定量PCR法检测这些浓度的苦参碱处理48 h后CNE2细胞p53 mRNA的变化;Western Blot检测其蛋白的变化情况。结果：MTT结果显示苦参碱具有抑制CNE1、CNE2细胞体外增殖作用,其抑制率存在浓度、时间依赖性。荧光定量PCR及Western Blot检测结果显示,苦参碱抑制CNE2细胞p53 mRNA和蛋白的表达,且亦呈浓度依赖性。结论：苦参碱抑制CNE2细胞的增殖,诱导细胞凋亡,呈现浓度、时间依赖性,其作用与抑制CNE2细胞中p53基因和蛋白的表达密切相关。     

黄芪、何首乌、女贞子、菟丝子混合提取物对体外培养毛囊生长的影响及药理作用研究

目的:通过体内外实验探讨黄芪、何首乌、女贞子、菟丝子混合中药提取物对毛囊增殖的影响作用以及其作用机理。方法:通过体外培养的C57BL/6小鼠毛囊器官模型观察不同浓度中药提取物对毛囊生长的影响;采用MTT法测定不同浓度中药提取物对毛乳头增殖的影响;蛋白免疫印迹法(Western Blot)和ELISA检测中药提取物对毛乳头细胞分泌肝细胞生长因子(HGF)的影响。结果:中药提取物能够刺激体外培养的小鼠毛囊的生长,800μg/mL浓度的促进作用最强;160μg/mL中药提取物对毛乳头细胞的增殖作用最强,与米诺地尔、齐墩果酸阳性对照存在显著性差异(P0.05)。而且,药提取物促进了毛乳头细胞分泌HGF。结论:黄芪、何首乌、女贞子、菟丝子混合中药提取物在促进毛发生长中起到重要作用,促进毛乳头细胞增殖和分泌HGF是促进毛囊生长的可能性药理机制。     

白黎芦醇对胃癌SGC 一7 901 细胞V EGF 表达的影响

目的：探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）在体外对胃癌SGC-7901细胞VEGF表达的影响。方法：体外培养胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测白藜芦醇对SGC-7901细胞的增殖抑制作用,RT—PCR方法检测VEGFmRNA表达,免疫细胞化学检测VEGF蛋白的表达。结果：白藜芦醇呈时间剂量性抑制胃癌细胞SGC7901的增殖;胃癌SGC-7901细胞高水平表达VEGF,白藜芦醇能显著降低胃癌SGC-7901细胞VEGFmRNA和蛋白表达。结论：白藜芦醇可以下调胃癌SGC-7901细胞VEGF的表达,抑制胃癌细胞的增殖。     

基质衍生因子(SDF-1)对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的:研究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4轴在骨髓间充质干细胞迁徙到受损胰腺中的作用。方法:密度梯度离心、贴壁培养骨髓间充质干细胞,建立STZ诱导糖尿病模型并制备正常和受损胰腺组织提取液,利用Transwell小室体外迁移体系观察不同浓度SDF-1和不同组织提取液对骨髓间充质干细胞的趋化作用,及SDF-1/CXCR4特异抑制剂AMD3100对骨髓间充质干细胞迁移的影响。结果:成功培养了骨髓间充质干细胞并建立了糖尿病大鼠模型。SDF-l对骨髓间充质干细胞有剂量依赖性的趋化作用,造模1周的胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞有明显的趋化作用,而这种作用可部分被SDF-1受体CXCR4的抑制剂AMD3100抑制。结论:受损胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞有明显的趋化作用,SDF-1/CXCR4轴可能在组织提取液趋化骨髓间充质干细胞迁移中起主要的作用。     

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium, mBMEC-CM),经超滤分为分子量>10 kDa组分和<10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响。用Wright’S Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]- TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用。结果显示,骨髓内皮细胞vWF 检测阳性。mBMEC-CM原液及其分子量>10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR 掺入量;分子量<10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activating protein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA。上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用。     

Adipose derived stem cells (ASCs) isolated from breast cancer tissue express IL-4, IL-10 and TGF-β1 and upregulate expression of regulatory molecules on T cells: do they protect breast cancer cells from the immune response?

Immunomodulatory function of bone marrow derived mesenchymal stem cells in cancer has recently been investigated. But the resident mesenchymal stem cells as whole in cancer and in the breast cancer tissue have not been studied well. In the present work we isolated adipose derived stem cells (ASCs) from breast cancer and normal breast tissues to investigate the expressions of IL-4, IL-10 and transforming growth factor (TGF)-β1 in ASCs and to see if ASCs isolated from patients can modulate the regulatory molecules on peripheral blood lymphocytes. Our results showed that IL-10 and TGF-β1 have significantly higher mRNA expressions in ASCs isolated from breast cancer patients than those from normal individuals (P value <0.05). The culture supernatant of ASCs isolated from breast cancer patients with pathological stage III induced upregulation of the mRNA expression levels of IL-4, TGF-β1, IL-10, CCR4 and CD25 in PBLs. In addition, the percentage of CD4+CD25^highFoxp3⁺ T regulatory cells was increased in vitro. When the same culture supernatant was added to ASCs isolated from normal subjects augmentation of the mRNA expressions of IL-4, IL-10, IL-8, MMP2, VEGF and SDF-1 in normal ASCs was also observed. These data collectively conclude that resident ASCs in breast cancer tissue may have crucial roles in breast tumor growth and progression by inducing regulatory molecules and promoting anti-inflammatory reaction within the tumor microenvironment. Further investigation is required to see if the immune suppression induced by ASCs is an independent property from tumor cells or ASCs gain their immunosuppressive potential from malignant cells.     

Increased invasiveness of osteosarcoma mesenchymal stem cells induced by bone-morphogenetic protein-2

To evaluate the different traits of mesenchymal stem cell (MSC) isolated from osteosarcoma (OS) and normal bone marrow (BM) induced by bone-morphogenetic protein-2 (BMP-2). MSCs from implanted osteosarcoma or femur bone marrow were isolated and cultured. Differentiation potency was verified and phenotypes were evaluated by flow cytometry. Increased or decreased expressions of BMP-2 were delivered by adenovirus and lentivirus vector, respectively. Expressions of VEGF, EMMPRIN, and MMP-9 were examined. Cell cycle, apoptosis, invasiveness, and proliferation assays were performed between the transfected groups and controls. Increased BMP-2 induced over-expression of VEGF, EMMPRIN, and MMP-9 in OS- and BM-MSCs both intra- and extra-cellularly. Decreased BMP-2 expression induced inhibition of the factors. Increased BMP-2 also induced less population of cells at G1 phase, more apoptotic cells, more cells that invade through Transwell membrane, and faster proliferation in OSMSC compared to those in BMMSC. BMP-2 induced higher expression of tumorigenic factors, which could be responsible for promoting the proliferation and aggressiveness of OSMSC over BMMSC.     

间充质干细胞-透明质酸-多聚赖氨酸治疗脊髓损伤的实验研究

目的研究间充质干细胞—透明质酸—多聚赖氨酸复合物治疗脊髓损伤的可行性,评价其治疗效果并探讨其可能机制。方法从人骨髓中分离、培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cell,hBMSC）;制作大鼠脊髓半横断模型,按照实验分组分别将hBMSC、透明质酸-多聚赖氨酸（hyaluronic acid-poly-L-lysine,HA-PLL）、hBMSC-HA-PLL复合物注入损伤区域,单纯损伤组作为对照。术后按照不同时间点评价损伤和移植后的大鼠运动功能。8周后杀死大鼠,观察不同移植组体内轴突和血管生长的情况,对不同细胞、材料及复合物移植对大鼠脊髓损伤修复效果进行评估。结果 hBMSC移植组和hBMSC-HA-PLL移植组的大鼠运动功能的改善显著好于单纯损伤及HA-PLL移植组。电镜结果证实复合物移植组可显著促进轴突和血管生长,新生的轴突和血管结构较为完整。结论 hBMSC具有促进神经功能恢复的作用,将其与HA-PLL相结合,可以促进大鼠脊髓损伤修复,其机制可能包括材料框架作用和hBMSC在体内对大鼠神经细胞的营养作用以及促进微血管的生成。     

猫骨髓间充质干细胞的体外分离培养、纯化、鉴定

目的:分离、培养、纯化家猫的骨髓间充质干细胞,并对获得细胞的表面标志物进行鉴定,为进一步利用骨髓间充质干细胞的细胞移植实验奠定基础。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化家猫骨髓间充质干细胞,通过多次更换培养液获得较纯化的骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下对细胞形态进行观察;根据第1、3、5、7、9代细胞的镜下增殖情况绘制出生长曲线;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD34、CD44和CD90的表达率。结果:在倒置相差显微镜下观察,分离培养的骨髓间充质干细胞贴壁呈梭形或纺锤形;原代细胞生长丛集成片,5~7 d达到融合,进行传代;培养到第三代以后,细胞出现相对均匀的梭形扁平外观,迅速增殖的细胞呈涡流样排列;第3、5代骨髓间充质干细胞增殖能力强于第7、9代;采用流式细胞仪分析结果显示细胞的CD34、CD44和CD90阳性率分别为17.5%、97.9%和91%,这与骨髓间充质干细胞表面抗原的表达一致。结论:分离培养的细胞具有骨髓间充质干细胞特性,成分相对单一,第3、5代细胞纯度高,增殖能力强,适用于进一步的实验研究。     

经穴注射BMSCs联合中药对大鼠血清VEGF、G-CSF、SDF-1浓度的影响

目的：前期基础实验发现经穴注射骨髓间充质干细胞联合益气活血中药对大鼠缺血后肢骨骼肌血管密度以及后肢血流恢复具有明显促进作用,为进一步明确其机制,本研究着重经穴注射骨髓间充质干细胞（BMSCs）联合益气活血方对大鼠血清中血管内皮细胞生长因子（VGEF）,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,基质细胞衍生因子-1（SDF-1）浓度的影响,从而为临床中医血管外科防治后肢动脉缺血性疾病提供新的思路和方法。方法：25只大鼠随机分为空白对照组（CG）、下肢缺血模型组（IG）、益气活血方缺血组（HG）、经穴注射BMSCs缺血组（BG）,经穴注射BMSCs＋益气活血方缺血组（BHG）,每组5只,在给予相应干预措施后,于7天后取血清,用酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中VEGF、G-CSF、SDF-1质量浓度。结果：1与CG比较,IG、HG、BG、BHG大鼠血清中VEGF、SDF-1、G-CSF浓度显著升高（P〈0.01）;2与IG比较,HG、BG、BHG组大鼠血清中VEGF,G-CSF浓度显著升高（P〈0.01）,BG、BHG大鼠血清中SDF-1浓度显著升高（P〈0.01）;3与HG比较,BG、BHG大鼠血清中VEGF,SDF-1,G-CSF浓度显著升高（P〈0.01）;4与BG比较,BHG大鼠血清中VEGF,SDF-1,G-CSF浓度显著升高（P〈0.01）,以上差异均有统计学意义。结论：经穴注射BMSCs联合益气活血中药可大幅提升下肢缺血模型大鼠血清中VEGF、G-CSF、SDF-1质量浓度,为临床中医血管外科防治后肢动脉缺血性疾病提供了新的思路和方法。     

Influence of perfusion and cyclic compression on proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells in 3-dimensional culture

Until now, there has been no in vitro model that duplicates the environment of bone marrow. The purpose of this study was to analyze proliferation and differentiation of human bone marrow stromal cells (hBMSC) under the influence of continuous perfusion and cyclic mechanical loading. hBMSC of seven individuals were harvested, grown in vitro, and combined. 10(6) hBMSC were seeded on a bovine spongiosa disc and incubated in a bioreactor system. Cell culture was continued using three different conditions: Continuous perfusion (group A), 10% cyclic compression at 0.5Hz (group B) and static controls (group C). After 24h, 1, 2, and 3 weeks, we determined cell proliferation (MTS-assay) and osteogenic differentiation (osteocalcin ELISA, Runx2 mRNA). Tenascin-C mRNA was quantified to exclude fibroblastic differentiation. In groups A and B, proliferation was enhanced after 2 weeks (48.6+/-19.6x10(3) (A) and 44.6+/-14.3 x 10(3) cells (B)) and after 3 weeks (46.6+/-15.1 x 10(3) (A) and 44.8+/-10.2 x 10(3) cells (B)) compared with controls (26.3+/-10.8 x 10(3) (2 weeks) and 17.1+/-6.5 x 10(3) cells (3 weeks), p<0.03). Runx2 mRNA was upregulated in both stimulated groups after 1, 2, and 3 weeks compared to control (group A, 1 week: 5.2+/-0.7-fold; p<0.01, 2 weeks: 4.4+/-1.9-fold; p<0.01, 3 weeks: 3.8+/-1.7-fold; p=0.013; group B, 1 week: 3.6+/-1.1-fold, p<0.01, 2 weeks: 4.2+/-2.2-fold, p<0.01; 3 weeks: 5.3+/-2.7-fold, p<0.01). hBMSC stimulated by cyclic compression expressed the highest amount of osteocalcin at all time points (1 week: 294.5+/-88.4 mg/g protein, 2 weeks: 294.4+/-73.3mg/g protein, 3 weeks: 293.1+/-83.6 mg/g protein, p0.03). The main stimulus for cell proliferation in a 3-dimensional culture of hBMSC is continuous perfusion whereas mechanical stimulation fosters osteogenic commitment of hBMSC. This study thereby contributes to the understanding of physical stimuli that influence hBMSC in a 3-dimensional cell culture system.     

Oncostatin M stimulates expression of stromal-derived factor-1 in human mesenchymal stem cells

Stromal-derived factor-1 (SDF-1) is a CXC chemokine that attracts leukocytes and endothelial progenitor cells. In the present study, we demonstrated that oncostatin M (OSM) stimulates expression and secretion of SDF-1 in both human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hATSCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. The OSM-stimulated expression of SDF-1 in hATSCs was completely abrogated by pretreatment of the cells with U0126, an MEK-specific inhibitor, but not with AG490, a JAK2 inhibitor, or WHI-P131, a JAK3 inhibitor, suggesting that ERK, but not JAK2 and JAK3, is involved in the OSM-induced expression of SDF-1. Pretreatment of hATSCs with anti-VEGF neutralizing antibody or VEGF receptor inhibitors, SU5416 and KRN633, had no significant impact on the OSM induction of SDF-1. Furthermore, treatment of hATSCs with recombinant human VEGF165 or adenoviral overexpression of VEGF did not increase the expression of SDF-1. These results suggest that OSM induces secretion of SDF-1 through ERK-, but not VEGF-, dependent signaling pathways in mesenchymal stem cells.