苏云金芽胞杆菌cry26Aa和cry28Aa基因共表达可在芽胞外壁内侧形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种的伴胞晶体在预芽胞外壁内侧形成,呈现晶体芽胞粘连的现象。根据已发表的cry26Aa1和cry28Aa1基因序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02中扩增得到cry26Aa和cry28Aa基因,通过穿梭载体将这两个基因分别和同时转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,透射电镜下可在芽胞外壁内侧和外侧同时观察到伴胞晶体,而单独表达时可在芽胞外壁外侧观察到伴胞晶体。结果表明,伴胞晶体在芽胞外壁内侧表达不单独依赖于启动子的时空调控,可能还受到晶体蛋白相互作用的影响。     

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象与晶体蛋白基因cry26Aa所在质粒有关

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02菌株的伴胞晶体在芽胞外壁内侧形成,呈现晶胞粘连的现象。在此菌株中克隆了cry26 Aa和cry28 Aa两个基因,并对晶胞粘连现象与质粒的相关性做了系统研究。通过消除幕虫亚种T02菌株的质粒,得到了仅消除cry26 Aa所在质粒的菌株BMB1151和无质粒的菌株BMB1152。通过穿梭载体将cry26 Aa和cry28 Aa两个基因分别和同时转化无质粒突变株BMB1152并表达,形成的晶体与芽胞独立存在不能粘连,表明在幕虫亚种染色体背景下仅仅cry的表达不能形成晶胞粘连现象,从而推断晶胞粘连现象可能与幕虫亚种两个基因所在的质粒有关;进一步的研究发现将cry26 Aa在仅消除cry26 Aa所在质粒的突变株BMB1151中表达,形成的晶体与芽胞也分别独立存在不能粘连,从而进一步推断幕虫亚种晶胞粘连现象与cry26 Aa所在质粒有关。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

四川盆地生态区苏云金芽胞杆菌cry基因的鉴定及新型模式cry基因的克隆

[目的]为了明确四川盆地生态区土壤中苏云金芽胞杆菌cry,基因资源情况,进一步克隆出新型的杀虫晶体蛋白基因.[方法]本研究主要通过菌株晶体形状的光学显微镜及扫描电镜观察、PCR-RFLP技术鉴定cry基因型法、杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析和菌株生物活性测定等方法对此地区菌株进行研究.[结果]从四川盆地不同生态区采集2650份土壤样品中分离了791株苏云金芽胞杆菌.PCR-RFLP鉴定结果表明:此地区的苏云金芽胞杆菌主要含有cry1,cry2,cry3,cry4/10,cry9,cry30和cry40等7种cry,基因类型;含cry1基因的菌株最丰富,共有21种不同cry1型基因组合;从中发现了新型模式基因,并采用Tail-PCR技术获得了其中3个基因的全长序列,被国际苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry54Aa1、cry30Fa1和cry30Ga1.通过生物活性测定,发现对鳞翅目和双翅目害虫具毒力的菌株.未鉴定出基因型的80个菌株的伴胞晶体SDS-PAGE分析表明:这些菌株均有40～130 kDa蛋白表达,极有可能含新型的杀虫蛋白基因.[结论]研究结果充分体现了四川盆地生态区苏云金芽胞杆菌资源的多样性及特殊性,所蕴含的杀虫蛋白基因在农业生产上具有重要意义和应用前景.     

苏云金芽胞杆菌sigK 基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影响

摘要: 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt) sigK 基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A 基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK 基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE 等方法分析了突变体的特点; 构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证; 利用启动子融合lacZ 技术检测了cry3A 基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢; 扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力; SDS-PAGE 分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315 携带sigK 基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力; sigK 基因的突变可以提高cry3A 基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A 启动子指导的Cry 蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK 基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量; sigK 基因功能的丧失有利于cry3A 基因启动子在产胞后期的转录。     

带cry3Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

N 乙酰高丝氨酸内酯 (N acyl homoserinelactones,AHLs) ,是一类数量感知 (Quorum sensing)系统中的信号分子 ,它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白能降解这类AHLs分子 ,进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子 ,它相对于其它cry类基因的启动子有启动基因转录时间早 ,转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR ,用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换编码AiiA蛋白的基因aiiA自身的启动子 ,构建了融合基因pro3A aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT3 0 4的BamHI SphI位点 ,得到重组质粒pBMB686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株BMB686的AiiA蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株 ,对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力也明显优于对照菌株     

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 ,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑     

苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB28的克隆

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020具有典型的晶胞粘连表型。在前期的研究中,通过质粒消除实验,推测晶胞粘连现象与YBT-020内生质粒pBMB28有关。为了定位质粒pBMB28上控制晶胞粘连表型的基因,首先对质粒pBMB28进行克隆。利用穿梭载体pEMB0557,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-020的基因组人工染色体(BAC)文库。前期的研究表明晶体蛋白基因cry28Aa定位在质粒pBMB28上,根据cry28Aa基因序列设计引物,从文库中筛选到含有cry28Aa的重组质粒pBMB231。镜检和SDS-PAGE证明质粒pBMB231转化无晶体突变株BMB171形成的重组子BMB231可以产生Cry28Aa晶体蛋白,但不能恢复晶胞粘连表型。对重组质粒pBMB231的插入片段末端序列测定并设计引物筛选文库,通过染色体步移方式得到4个可以重叠覆盖质粒pBMB28不同区域的克隆子,从而克隆了该质粒。对这4个克隆子末端测序和酶切分析,测算出该质粒的大小约为140 kb。进一步确定应用基因组BAC文库以及重叠片段筛选的方法,可以快速有效的克隆苏云金芽胞杆菌大质粒。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体

将cry1Ac10基因和苏云金芽胞杆菌的复制起始区连 接在一起,并在其两侧按相同方向各连接一个来自苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离位点,构成转移单位。再将革兰氏阳性细菌的抗性标记基因和大肠杆菌克隆载体pUC19与之连接,获得含cry1Ac10基因的解离载体pBMB801。将其转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变体,再导入含解离酶基因的辅助质粒pBMB1200。在解离酶作用下,两个解离位点间发生重组,消除基在操作中的抗性标记基因等非必需基因片段,获得仅保留有完整cry1Ac10基因和来 自苏云金芽胞杆菌质粒复制起始区,在无抗生素选择压力下能稳定遗传的重组质粒pBMB801B 。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种HD-133 cry1D和cry1AbmRNA含量及稳定性研究

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种菌株HD\|133含有代表性的三种cry1类基因cry1Ab,cry1C和cry1D,它们的表达量却明显不同。通过Northern杂交检测了菌株HD\|133中基因cry1D和cry1Ab的mRNA含量及其稳定性。结果表明：基因cry1D mRNA的形成比基因cry1Ab的mRNA滞后3h,且基因cry1D形成mRNA的量很低,产生过程很平稳,在芽胞形成中期比cry1Ab mRNA低37倍;cry1Ab mRNA含量在芽胞形成前期高于后期,在后期仍能大量持续稳定地转录。cry1D mRNA的半衰期为18min,而cry1Ab mRNA的半衰期为14min。尽管cry1D mRNA比cry1Ab mRNA的半衰期更长,但cry1D和cry1Ab转录时间和转录量的差异是导致其表达量差异的重要原因。     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Southern杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌(\%Bacillus thuringiensis)\% YBT1520菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其5’末端所在HindⅢ片段分别为68kb和46kb,它们对应的基因分别命名为cry218和cry46。经PCR鉴定,该菌含有cry1Aa\,cry1Ab和cry1Ac基因,以及cry2基因,其中cry218属于cry1Ac。分析了cry218基因4190bp的核苷酸序列,在杀虫晶体蛋白基因分类系统中被命名为cry1Ac10。结合Southern杂交和PCR结果可判断3个cry1A基因的拷贝数不同,其中cry1Ac拷贝数最高,YBT1520菌株与其它库斯塔克亚种的杀虫晶体蛋白基因所在限制性内切酶位置明显不同。     

芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达

【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。     

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种HD-133cry1D的表达调控

利用PCR扩增基因cry1D启动子及上游区片段,在测序的基础上构建含cry1DlacZ融合基因穿梭质粒,导入不同遗传背景的苏云金芽胞杆菌菌株中,并以cry1AblacZ融合基因为对照测定β半乳糖苷酶活性,检测启动子上游区的作用。结果表明,cry1DlacZ和cry1AblacZ融合基因在不同遗传背景的菌株中表达完全不同,也许一些宿主专一性的因子参与了转录调控;而在同一菌株中Ccry1DlacZ和cry1AblacZ的表达差异是由于上游区的不同以及竞争有限的σ因子所致。利用PCR定点诱变技术突变其SD序列GGGGA为GGAGG后,cry1DlacZ融合基因的表达提高了1.0～1.6倍。表明GGAGG是苏云金芽胞杆菌合适的SD序列,也揭示了不合适的SD序列是cry1D表达量低的原因之一。     

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

cry8E启动子指导的非晶体蛋白GabR在苏云金芽胞杆菌HD73菌株中的表达

【目的】利用cry8E基因启动子指导的高效表达载体pHT315-8E21b,构建一个能够在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中正确表达非晶体蛋白GabR的重组菌株。【方法】将苏云金芽胞杆菌中的功能基因gabR装载到cry8E基因启动子指导的高效表达载体pHT315-8E21b上,转入到HD73-无晶体突变株后获得重组菌株HD-8E-gabR。通过SDS-PAGE和凝胶阻滞等方法对GabR蛋白的表达和功能进行分析。【结果】通过SDS-PAGE及蛋白定量等方法首次证明了在Bt表达体系中cry8E基因启动子指导的高效表达载体能够表达非晶体蛋白GabR,且通过碱裂解的方法可以提高GabR蛋白在Bt系统中的溶解性。进一步凝胶阻滞试验证明GabR能与其调控启动子PgabT结合。【结论】证明了cry8E基因启动子指导的Bt表达系统具有大量表达非晶体类蛋白的能力。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。