人体β—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的…

人β－珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和Ｋ５６２细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及Ｋ５６２细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件（－３７２到－１９４ｂｐ）相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和Ｋ５６２细胞中的调控因子与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合     

与人体β-珠蛋白基因5'旁侧正调控区(PCR)相结合的调控因子(简报)

β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的理想模型,在它的5个结构基因(ε,~Aγ,~Gγ,δ和β)中,成年型的β-珠蛋白基因主要在出生后人的骨髓中表达。过去的研究表明,在β-珠蛋白基因的5′旁侧序列内至少存在三个调控元件,即两个负调控区     

与人体ε-珠蛋白基因5''''旁侧正调控元件(ε-PREI)专一结合的调控因子的初步研究

人体ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析法发现在胚胎型红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子（简称ε－ＳＳＰ,其分子量大约为８０ｋＤ）,它能专一地与人体ε－珠蛋白基因５′旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥＩＩ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合。竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥＩＩ的结合能被人体ε－珠蛋白基因启动子区ＤＮＡ片段（－１７７ｂｐ到＋１ｂｐ）所竞争;同时也能被人体β－类珠蛋白基因远侧端调控元件ＬＣＲ中的ＤＮａｓｅＩ超敏感点Ｉ核心区ＤＮＡ片段（－１０９６５ｂｐ到－１０６８１ｂｐ）与超敏感点ＩＩ核心区ＤＮＡ片段（－１４９９３ｂｐ到－１４７１８ｂｐ）所竞争。我们的结果提示了ε－ＳＳＰ不仅是一个与红细胞专一性和发育时期特异性相关的反式调控因子,而且它可能介导远侧端调控元件（ＬＣＲ）与近侧端调控元件启动子之间的相互作用,共同调节ε－珠蛋白基因在胚胎期的表达。     

与人体ε—珠蛋白基因5‘旁侧正调控元件（ε—PREⅡ）…

人体ε－珠蛋白基因５’旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用交电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析法发现在胚胎裂红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子,它能专一地与人体ε珠蛋白基因５‘旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥⅡ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥⅡ的结合能被人体ε－     

羟基脲(Hydroxyurea)对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响(简报)

已有许多证据表明羟基脲能增加镰状细胞贫血及β-地贫病人的胎儿型血红蛋白(HbF)的合成。最近,有人报道羟基脲也能使一些患有β-地贫病人的β-珠蛋白基因表达增加。K562细胞是人红白血病细胞株,它只能表达胚胎型(ε-)与胎儿型(γ-)珠蛋白基因,而不能表达成年型(β-)珠蛋白基因。因此,K562     

基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体转染法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT-PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2-HS3及近侧元件在瞬时表达中对β-珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况.结果显示,3.2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β-启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无明显协同作用.     

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件位于ε-珠蛋白基因5’上游20Kb内,由四个DNase-Ⅰ超敏感点(HS1-HS4)组成。已有转基因实验表明,HS3可能与发育早期的胚胎型ε-珠蛋白基因表达调控相关。基因调控是通过调控元件与调控因子的相互作用而完成的。为了揭示HS3的调控作用,我们选用了发育不同时期的小鼠胚胎造血组织作为材料,用凝胶电泳阻抑法,分析了调控因子与HS3的结合。我们的实验结果表明,怀孕13天和18天的小鼠胚胎造血组织的核蛋白因子与HS3的结合模式完全不同;同时我们用Southwestern Blot的方法进一步证明了这种差异性的存在。现已知HS3中有GA-TA和CACCC两类转录因子结合的motif,采用竞争实验分析,发现CACCC motif对结合区带没有竞争作用,而GATA有竞争作用;另外还存在没有被竞争的条带,我们推测它们可能是一类新的、发育时期专一性的核蛋白因子。Western Blot的实验结果表明,在基因调控过程中起到重要作用的红系转录因子GATA家族中的GATA-1和GATA-2的表达也具有时期专一性:即怀孕13天的小鼠造血组织中表达GATA-2,不表达GATA-1;而怀孕18天的小鼠造血组织中则表达GATA-1,不表达GA-TA-2。因此,我们推测,HS3很可能参与时期专一性的基因表达调控,其中时期专一性的蛋白因子可能起到了重要作用。     

γ-珠蛋白基因表达调控机制与临床应用

成人体内的血红蛋白是由2个 α-珠蛋白和2个β-珠蛋白组成的四聚体,负责氧气的运输。珠蛋白基因在基因组中成簇分布,其表达受到多种顺式作用元件和反式作用因子的共同调控,具有高度的组织特异性和发育时序性。β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血是两种最常见的由于β-珠蛋白基因突变引起的常染色体隐性遗传病。γ-珠蛋白是一种主要在胎儿时期表达的类β-珠蛋白,同样具有载氧功能,但编码该蛋白的基因在上述贫血患者中却保持完好。因此,临床上优选的治疗方案之一是重新激活患者体内沉默的γ-珠蛋白基因的表达来弥补缺损的β-珠蛋白,从而缓解临床症状。目前已有多种能提高γ-珠蛋白基因表达的药物,在临床上用于治疗β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血。随着基因组编辑技术的发展,针对这两种贫血的精准基因治疗研究也在进行中。本文着重介绍了参与γ-珠蛋白基因调控的转录因子和表观遗传修饰分子,以及目前相关的β-地中海贫血和镰刀型细胞贫血的临床治疗药物和手段,以期为深入阐明γ-珠蛋白基因的转录表达分子调控机制提供参考。     

基因座控制元件HS2、HS3对β—珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体杂法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT－PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2－HS3及近侧元件瞬时表达中对β－珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况。结果显示,3．2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β－启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无协同作用。     

人类珠蛋白基因表达调控机制研究进展

人类β珠蛋白基因簇的顺次切换表达机制包括：在转录水平多个转录调控元件如LCR,EKLF,CCAAT等的作用。在转录后各mRNA的翻译及加工也受到影响。而α珠蛋白基因簇的切换机制则为ξ基因的关闭,另外,α及β－mRNA 3′UTR结构对其自身稳定性具有决定性作用,并进而影响其蛋白质水平。     

碱性Krueppel样因子对和珠蛋白基因的转录调控作用

为探索碱性Kruppel样因子（basic Krueppel-like factor,BKLF)对γ-和ε珠蛋白基因的转录调控作用,构建了人类BKLF(hBKLF)基因全长及N端缺失40个氨基酸的真核表达载体,并将其瞬时转染到COS7细胞中做报告实验。结果表明,hBKLF能够抑制γ-和ε-珠蛋白基因启动子的活性,而hBKLF特异的反义核酸则激活这两种基因的启动子。N端缺失40个氨基酸不影响这种转录抑制功能。hBKLF强烈抑制FKLF(embryonic/fetalβ-like globin gene-activating Krueppel-like factor)引起的对γ-和ε-珠蛋白基因的转录激活作用。另外BKLF基因能够与SHP1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase1)基因启动子区的CACCC元件结合。这些结果提示γ-和ε-珠蛋白基因可能是BKLF的转录调控对象,为研究BKLF参与血细胞特异表达基因的调控提供了依据。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

羟基脲诱导前后HEL细胞内GATA转录因子与人β—类珠蛋白基因调控元件的结合模式分析

HEL细胞是一株人红白血病细胞株,其中成年型β-珠蛋白基因不能表达。我们以往的试验证明,羟基脲诱导以后,能使HEL细胞内成年型β-珠蛋白基因表达。本文以此为模型,探索了β-珠蛋白基因在HEL细胞内诱导表达的分子机制。结果表明,羟基脲诱导之后,与人β-珠蛋白基因5’远侧端DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列以及近侧端启动子DNA序列相结合的GATA-1蛋白因子量明显增多,而GATA-2蛋白因子量明显减少。结果显示,GATA蛋白家族各成员在HEL细胞分化及珠蛋白基因表达的过程中扮演着不同的角色。推测GATA-1可能有促进β-珠蛋白基因的表达,使HEL细胞趋向终末分化的作用,GATA-2则可能与胚胎型珠蛋白基因表达有关,并有抑制红细胞向终末分化的功能。     

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

人δ珠蛋白基因表达调控研究进展

人δ珠蛋白基因是次要成年功能性β类珠蛋白基因,位于１１号染色体短壁β珠蛋白基因簇中,γ珠蛋白基因之后,β珠蛋白基因之前。,     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β－珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT－PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素（Hm)对K562细胞中β－珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ－珠蛋白mRNA水平升高,其β－珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β珠蛋白基因的转换机制相关。     

人β球蛋白基因5‘旁侧远端新沉墨子区的功能和鉴定

为探讨β珠蛋白基因５‘旁侧远端及／或δ－β基因间序列调控中所起的作用本文重组含不同长度５’旁侧远端上序列的β基因逆病毒载体并转染Ｈｅｌａ细胞,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ凶迹杂交和ＲＴ－ｃｐＣＲ竞争性定量检测β基因在Ｈｅｌａ细胞中的稳定表达水平,发现在β基因上游约１．８ｋｂ处存在一强默子活性区;进而通过竞争性凝胶阻滞分析主要定位于一长为３１０ｂｐ的ＤＮＡ片段中,从中发现众多调控相关序列;用荧光素酶报告基因瞬     

胎儿血红蛋白的表达调控

胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰刀型细胞贫血发病原因均基于β-珠蛋白基因发生突变,致使β-珠蛋白合成不足或异常,进而引起一系列临床症状。诸多实验结果及临床疗效表明,提高患者体内γ-珠蛋白的表达可部分替代异常β-珠蛋白从而有效缓解患者的临床症状。随着基因治疗的发展,如何安全高效的再激活胎儿血红蛋白的表达成为治疗β型地中海贫血和镰刀型细胞贫血患者的重要科学命题。本文重点回顾近年来γ-珠蛋白表达的调控机制,以期对寻找更加有效激活胎儿血红蛋白的方法提供参考。     

人α—珠蛋白基因表达调控研究进展

人α－类珠蛋白基因簇位于１６号染色体的短臂近端粒区,由４个功能基因和３个假基因组成,其中,ζ－珠蛋白基因在胚胎期表达,α２、α１和θ珠蛋白基因在胎儿和成人期表达。α－类珠蛋白基因的主要调控序列位于ζ－珠蛋白基因上游４０ｋｂ的位置,称为ＨＳ－４０,另外还存在其它的ＨＳ－位点。在ＨＳ－４０和各种珠蛋白基因启动子上有多种红系和通用反式作用因子的结合位点,它们间的协同作用保证了α－类珠蛋白基因表达的组织和     

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游－2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游－2 537～－1 537 bp之间存在负调控元件,在－253～－157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至－2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节.